【摘 要】
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以奶牛为研究对象，以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点，基于BAC重组酶系统构建乳腺特异表达tPA药物蛋白的多位点基因打靶载体，为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。tPA属于丝氨酸蛋白酶家族成员，体内主要由血管内皮细胞合成分泌，是一种生理性纤溶酶原激活剂，应用于临床溶栓药。首先根据已有报道Keyt等人采用定点突变的方法改造tPA以延长tPA的半衰期，将Asn103换为Thr，Asn11
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以奶牛为研究对象，以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点，基于BAC重组酶系统构建乳腺特异表达tPA药物蛋白的多位点基因打靶载体，为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。tPA属于丝氨酸蛋白酶家族成员，体内主要由血管内皮细胞合成分泌，是一种生理性纤溶酶原激活剂，应用于临床溶栓药。首先根据已有报道Keyt等人采用定点突变的方法改造tPA以延长tPA的半衰期，将Asn103换为Thr，Asn117换为Gln，296～299的LysHisArgArg换为AlaAlaAlaAla，该突变体的体内清除率下降8倍。接着构建pYLSV-pBC1-tPA乳腺特异表达载体，然后将本课题组成员之前构建的BAC-TDN-GD筛选载体和pYLSV-pBC1-tPA表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中，通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-GD-SV-pBC1-tPA质粒，采用归位内切酶PI-Sce I切除pYLSV载体骨架，构建奶牛乳腺特异表达多位点基因打靶载体BAC-TDN-PT-GD，利用接头LS使之环化。将打靶载体BAC-TDN-PT-GD用阳离子脂质体转化胎牛成纤维细胞，转化24小时后可观察到GFP荧光表达。以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决目前存在的打靶效率低、安全性等问题。本论文为建立一系列药物蛋白的奶牛乳腺特异性表达多位点基因打靶系统奠定基础。
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