目的:ETV4为ETS转录因子家族中PEA3亚家族的成员之一,其高表达与多种肿瘤生长与转移相关。课题组前期研究表明,ETV4基因在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）组织中的表达显著增加,并且与肿瘤生长、转移、患者不良预后呈显著正相关。为明确ETV4调控的下游靶点,我们进一步通过表达谱芯片检测了敲低ETV4对三个NSCLC细胞基因表达的影响,发现伴随ETV4敲低而显著上调的基因主要与纤毛形成密切相关。原发的纤毛又叫初级纤毛,是由细胞中心粒发出的以平行微管为基础结构的天线状细胞器,通过大量的受体和连接的信号通路感知细胞外环境,参与细胞周期、细胞增殖、细胞自噬、细胞代谢的调控。纤毛功能障碍会引起一系列人类发育障碍的疾病并引起相应的病理改变,特别是当肿瘤细胞失去了原发纤毛会增加肿瘤细胞的恶性程度。因此,基于芯片筛选结果,我们推测:ETV4可能通过转录抑制纤毛相关基因表达参与NSCLC细胞多种信号通路的调节过程。所以,本研究在验证基础上,聚焦ETV4对纤毛形成关键基因DNAH7、ENKUR表达的调控机制进行了探讨,为阐明ETV4在肺癌中的癌基因作用提供理论依据。方法:1.细胞培养:含1%青霉素/链霉素的双抗及10%胎牛血清的DMEM培养基贴壁培养H1703、H1299和H358细胞;H358T细胞为实验室保存细胞,是经过TGF-β长期处理H358细胞后获得,ETV4表达较本底细胞增加。2.细胞转染:分别在上述NSCLC细胞中转染siRNA敲低ETV4、DNAH7、ENKUR表达;转染ENKUR表达载体过表达ENKUR;H358细胞中转染ETV4表达载体后用于后续实验。3.表达谱芯片检测:H1703、H1299及H358T细胞转染NC-siRNA或si-ETV4后进行芯片检测,由上海康城公司提供服务。4.qRT-PCR方法:检测ETV4与纤毛相关基因在mRNA水平的表达。5.Western Blot方法:检测ETV4、纤毛相关基因对相关通路中蛋白表达的影响。6.染色质免疫共沉淀（Chip）方法:分析ETV4在靶基因启动子区的结合情况。7.免疫荧光染色及共聚焦显微镜观察:检测ETV4、DNAH7、ENKUR对NSCLC细胞纤毛形成及β-catenin定位的影响。8.细胞胞质-核分离:分离获得胞浆蛋白和胞核蛋白,并结合Western Blot方法分析DNAH7、ENKUR对β-catenin定位及表达的影响。9.流式细胞术（FCM）检测:观察DNAH7、ENKUR对NSCLC细胞周期分布的影响。10.MTT实验:检测ETV4-DNAH7、ENKUR对NSCLC细胞增殖能力的影响。11.统计分析:数据以平均±标准差（SD）表示,使用GraphPad Prism软件对实验数据进行t检验、单因素方差分析（ANOVA）和双因素差分析。SPSS13.0统计软件对实验数据应用卡方检验方法分析。P＜0.05时认为有统计学意义。结果:第一部分:ETV4转录调控DNAH7、ENKUR基因表达影响NSCLC细胞纤毛形成1.纤毛相关基因表达在ETV4敲低后显著上调表达谱芯片检测结果表明,敲低ETV4后3个NSCLC细胞中与纤毛功能相关的33个基因表达显著上调（FC＞2且P＜0.05）。GO分析表明上述基因与 Cilium assembly 和 Cilium organization 等过程有关。结合 TCGA数据库分析上述基因是否在NSCLC中表达降低,最终选定14个基因进一步通过qRT-PCR在H1703、H1299、H358T细胞中进行验证。qRT-PCR结果表明,WDR78、ENKUR、RSPH1、DNAH7、LCCR6基因表达与芯片结果一致（P＜0.05）。本实验中我们选定DNAH7与ENKUR进行后续研究工作。2.ETV4转录调控NSCLC细胞中DNAH7、ENKUR基因表达在上述验证基础上,进一步通过Chip-PCR方法检测ETV4是否结合于DNAH7、ENKUR基因启动子区。H1299细胞中利用anti-ETV4 Chip-PCR检测发现,内源性ETV4可以与DNAH7以及ENKUR的启动子区结合。此外,在H358细胞中过表达Flag-ETV4后,利用anti-Flag抗体检测表明,外源性ETV4同样能够结合于DNAH7、ENKUR基因启动子区。结果表明ETV4在转录水平调控DNAH7和ENKUR的表达。3.DNAH7、ENKUR对NSCLC细胞增殖能力的影响MTT检测结果表明,H1703、H1299、H358T细胞敲低DNAH7后增殖活性均明显高于对照组（P＜0.05）;敲低ENKUR后的增殖活性明显低于对照组（P＜0.05）;过表达ENKUR后的增殖活性明显高于对照组（P＜0.05）。在NSCLC细胞中敲低ETV4后细胞的增殖活性均明显低于对照组（P＜0.05）,而当同时敲低ETV4与DNAH7或ETV4与ENKUR之后,细胞的增殖活性却有所回复（P＜0.05）。4.DNAH7、ENKUR对NSCLC细胞周期分布的影响纤毛多在G0/G1期进行组装,发挥生物学功能,所以我们进一步分析DNAH7、ENKUR对细胞周期的影响。流式细胞术检测结果表明,转染 si-DNAH7 敲低 DNAH7 表达后,H1703、H1299、H358T 细胞中 G0/G1期细胞比例显著降低,且发生S期阻滞（P＜0.05）,而转染了 si-ENKUR敲低ENKUR后,H1703、H1299、H358T细胞中发生G0/G1期阻滞,同时在H1299、H358T细胞中G2/M期细胞比例显著降低（P＜0.05）。5.NSCLC细胞同步化至不同细胞周期对纤毛形成的影响不同细胞周期影响细胞纤毛的形成。我们首先参照文献方法,给予H1703、H1299、H358T 细胞 Thymidine 或 Nocodazole 处理分别同步化至G0/G1期、S期或G2/M期,经FCM及Western Blot证实细胞同步化后,以Acetylated-Tublin（Ac-Tublin）为纤毛标记,采用IF检测细胞纤毛形成随周期改变的情况。结果发现在3个NSCLC细胞系中,G0/G1期细胞纤毛阳性细胞的比例、纤毛长度显著高于其他分期（P＜0.01）。6.ETV4对NSCLC细胞纤毛形成的影响前期结果表明ETV4敲低后细胞周期发生G0/G1期阻滞,纤毛相关基因表达显著上调,并且在NSCLC细胞中敲低ETV4后Histone deacetylase 6（HDAC6）的表达水平升高,影响细胞整体乙酰化水平。所以我们探究ETV4对NSCLC细胞纤毛形成的影响时,在H1703、H1299、H358T细胞中敲低ETV4并联合应用HDAC6的抑制剂Tubacin,以Ac-Tublin与Arl13B作为纤毛的双重标记,发现在3个NSCLC细胞系中,纤毛阳性细胞的比例、纤毛长度显著高于其他分组（P＜0.05）。7.DNAH7、ENKUR对非小细胞肺癌细胞纤毛形成的影响纤毛的表达在某种程度上反映细胞的周期阶段及复制能力。我们在H1703、H1299、H358T 细胞中分别转染 NC siRNA、si-DNAH7、si-ENKUR和Empty vector、ENKUR vector 48小时后进行免疫荧光染色并用共聚焦显微镜检测纤毛的表达情况。结果提示转染了 si-DNAH7、si-ENKUR的细胞与对照组相比纤毛表达量明显减少（P＜0.05）,而转染了 ENKUR vector的细胞纤毛的表达量明显增多（P＜0.05）。第二部分:ETV4调控DNAH7、ENKUR表达参与NSCLC细胞mTOR以及Wnt/β-catenin信号通路的调节1.ETV4-DNAH7、ENKUR对非小细胞肺癌细胞mTOR信号通路的影响1.1 DNAH7、ENKUR对NSCLC细胞mTOR信号通路的作用mTOR通路作为肿瘤细胞能量代谢及增殖的重要信号通路,我们在H1703、H1299、H358T 细胞中敲低 DNAH7、ENKUR,过表达 ENKUR检测mTOR通路活性的代表分子p-S6K的表达。Western-blot结果提示,在总S6K的表达量没有较大差异的前提下,在3个NSCLC细胞系中敲低DNAH7和过表达ENKUR后p-S6K的表达水平上升,而敲低ENKUR后p-S6K的表达水平明显下降。1.2 ETV4-DNAH7、ENKUR对NSCLC细胞mTOR信号通路的作用在NSCLC细胞中转染了 si-ETV4后通过Western Blot检测p-S6K的表达水平相比转染NC siRNA显著下降,而当我们同时转染了 si-ETV4与si-DNAH7、si-ETV4与si-ENKUR后发现p-S6K的表达水平有所回复。2.ETV4-DNAH7、ENKUR对非小细胞肺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响2.1 DNAH7、ENKUR 对 NSCLC 细胞β-catenin 表达的影响β-catenin信号通路与细胞增殖等方面有密切关联。Western Blot结果提示在H1703、H1299、H358T细胞中敲低DNAH7和过表达ENKUR后,β-catenin表达水平显著上升;但在3个NSCLC细胞系中敲低ENKUR后β-catenin的表达量却没有明显改变。2.2 DNAH7、ENKUR 对 NSCLC 细胞β-catenin 定位的影响β-catenin在影响细胞增殖的信号通路时会有核易位的情况出现。我们通过核浆分离和Western Blot检测发现敲低DNAH7后β-catenin在核蛋白的表达升高,且免疫荧光共聚焦显微镜观察到敲低DNAH7后β-catenin有明显的核定位的表达,而敲低ENKUR或者过表达ENKUR后β-catenin却没有明显的核易位情况。2.3 ETV4-DNAH7、ENKUR 对 NSCLC 细胞β-catenin 表达的影响在 H1703、H1299、H358T 细胞中转染了 si-ETV4 后 Western-blot 检测β-catenin的表达水平相比转染NC siRNA显著下降,代表ETV4与细胞增殖密切相关,而当我们同时转染了 si-ETV4与si-DNAH7、si-ETV4与si-ENKUR后发现β-catenin的表达水平有所回复,所以在NSCLC细胞系中ETV4联合DNAH7、ENKUR等基因的表达影响细胞增殖等信号通路。结论:1.纤毛形成与细胞周期进展相关,在进入G0/G1期时被组装,有丝分裂前被拆卸。2.转录因子ETV4可影响非小细胞肺癌细胞中多个纤毛相关基因表达,与纤毛形成相关。抑制ETV4表达引起NSCLC细胞中纤毛相关基因表达普遍上调,对延缓肿瘤发展进程起着重要的作用。3.ETV4转录调控纤毛关键基因—DNAH7与ENKUR基因表达,影响NSCLC纤毛形成、细胞周期进展与增殖能力。4.ETV4调控DNAH7、ENKUR表达参与纤毛相关信号通路——mTOR以及Wnt/β-catenin信号通路的激活,是促进非小细胞肺癌细胞发生发展的重要机制之一。