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背景:类风湿关节炎为慢性系统性自身免疫、炎症性疾病,滑膜成纤维细胞在它的疾病进程中发挥至关重要的作用。sirtuins属于III类组蛋白脱乙酰酶,使用NAD+作为其酶活性的共基质调节底物的乙酰化水平和活性,参与包括基因沉默、DNA修复、细胞凋亡、物质合成或分解、衰老及炎症等诸多机体生命活动过程。近些年来在慢性疾病中sirtuins备受关注,例如一些较常见的疾病:肥胖、代谢综合征、冠心病、关节炎等,其中SIRT 1在减轻炎症方面发挥着重要作用。SIRT1可通过调控NF-κB调节包括白介素-6、白介素-1、以及TNF-α等在内的众多信号分子以及炎症因子,进而起到减轻炎症及细胞保护作用。SIRT 1在肿瘤和炎症性疾病,特别是在关节炎中的作用仍存在争议。在人类滑膜中SIRT 1具有促进细胞生长和细胞凋亡抗性的作用。然而,SIRT 1的缺失加重了小鼠的炎症性关节炎,增加了促炎细胞的产生,SIRT1表达增加可抑制RA-FLS侵袭性。目前sirtuin(SIRT)1在RA(Rheumatoid Arthritis)中的作用尚不确定,值得注意的是众多小鼠实验中SIRT1都显示出具有保护关节作用,但其在人RA关节组织中的作用及机制仍需要进一步实验证明。目的:拟通过SIRT1通过NF-κB途径抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的侵袭性,寻找治疗类风湿关节炎的新的治疗靶点。方法:1.首先,提取研究对象滑膜组织中的滑膜成纤维细胞:纳入苏北人民医院类风湿关节炎患者且将进行关节置换或滑膜切除术的RA患者10例,取创伤性膝关节患者10例作为对照组。在手术过程中所获得所有研究者滑膜组织样本,通过胰蛋白酶等消化分解滑膜组织,然后提取并分离FLS,分为两组即类风湿关节炎FLS组(RA-FLS)以及非自身免疫FLS组(NC-FLS)。并将FLS在特定培养液中培养传代用于下一步实验。2.SIRT1转染RA-FLS:将度表达载体PCDNA3.1-SIRT1和PCDNA3.1转染后的RA-FLS细胞,用于细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭实验。3.SIRT1对RA-FLS细胞增殖、凋亡的影响。3.1我们采用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)测定RA-FLS增殖情况并进行对比评估。3.2用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒以及流式细胞技术(FACS)等方法进行分析以及计算经SIRT1处理的RA-FLS凋亡率,并与未转染SIRT1的RA-FLS进行对比。4.SIRT1对RA-FLS细胞迁移、侵袭的影响。4.1使用划痕实验检测PCDNA3.1-SIRT1和PCDNA3.1转染后RA-FLS的迁移能力。4.2用Transwell小室侵袭实验,检测被转染PCDNA3.1-SIRT1和PCDNA3.1的滑膜成纤维细胞Transwell小室侵袭细胞数。4.3对比PCDNA3.1-SIRT1和PCDNA3.1对RA-FLS迁移及侵袭的影响5.SIRT1对RA-FLS中促炎细胞因子的产生和NF-κB相关蛋白的表达影响。5.1通过ELISA(酶联免疫吸附)试验检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8的浓度。5.2用蛋白印记法(western blot)测定NF-κB蛋白表达:抗NF-κB p65(B 16502)、磷脂-NF-κB p65(Ser 536)、(Ab76302)、乙酰NF-κB p65(Lys 310)(Ab19870)、SIRT1(Ab110304)和GAPDH(Ab8245)等的表达。5.3敲低NF-κBp65后再次进行细胞迁移、侵袭实验。6.统计学方法:t检验评价两组间差异的显着性。采用单因素方差分析和图基(tukey)事后检验法检验差异的显着性。所有数据采用SPSS 19软件包进行统计分析。P<0.05有统计学意义。结果:1.SIRT1的过度表达明显抑制了RA-FLS的增殖、诱导RA-FLS的凋亡。2.SIRT1可以抑制RA-FLS的迁移和侵袭。3.SIRT1降低了RA-FLS中促炎细胞因子的产生和NF-κB相关蛋白的表达。4.敲低p65表达可部分逆转SIRT1对RA-FLS迁移和侵袭的抑制作用。结论:SIRT1可通过NF-κB途径抑制RA-FLS的迁移和侵袭。