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在靶向药物出现之前,胃肠问质瘤(Gastrointestnal stromal tumors,GlsTs)的总体予页后较差,一般地行完整手术切除后5年总体生存率(0ve rall su rvival,0s)仅32—63%,而且高危型患者予页后更差,RO切除后5年无复发生存率(Recurrence—free survival,RFs))甚至低至20%,究其原因,肿瘤转移是导致GlsTs患者治疗失败和死亡的主要因素。前期基于临床和病理数据的研究显示,肿瘤大小及核分裂像是影响GlsTs予页后的关键因素,其组合形成的危险度分层是有效判定GlsTs患者远期疗效的重要依据。我们知道,不同危险度分层的GlsTs之间远期疗效差异显著,遗憾的是,导致这种疗效差异的潜在分子基础至今仍不十分清楚。有研究发现,GlsTs可能起源于胃肠道问质组织起搏细胞cajal,而原癌基因KlT及PDGFRa突变产生的酪氦酸激酶信号通路激活可能是其发生的重要分子机制,约75—80%GlsTs呈KlT基因突变表型(即免疫表型KlT阳性),因此KlT基因突变也被认为是GlsTs最主要的基因突变类型。为此,本研究以免疫表型KlT阳性而危险度分层不同的胃肠问质瘤为研究对象,首先应用Real time—PcR双向测序法对高、低危型GlsTs原癌基因KlT与PDGFRa的突变特征进行分忻;随后采用基于双向凝胶电泳技术及质谱分忻体系的比较蛋白质组学策略筛选并鉴定高危型与低危型GlsTs之间的差异表达蛋白,并应用生物信息学分忻工具对差异蛋白进行总体分子特性的分忻;最后通过免疫组化染色方法进行验证,并结合临床随访数据以期筛选若干对GlsTs转移潜能及予页后具有潜在予页警价值的蛋白分子。本研究第一部分首先选取两类危险度分层差别显著、免疫表型KlT阳性GlsTs组织(包括高危型和低危型各5例),应用RT_PcR直接测序法对GlsTs原癌基因KlTexon-9、11、13和17与PDGFRa exon一12和18进行基因突变检测,初步获得免疫表型KlT阳性高危型与低危型GlsTs原癌基因KlT及PDGFRa的突变特点。其中,exon-11是GlsTs原癌基因KlT最为常见的突变位点,其5’端第550一第560密码子附近区域是exon-11的突变“热区”,而第557—558号编码色氦酸(Trp)和赖氦酸(Lvs)的密码子。rGGAAG等6个核苷酸序列的缺夫可能是高危型GISTs的独特突变特征。我们发现,结合基因突变分型的分子分型可进一步提高以临床病理数据为基础的危险度分层的准确性。本研究第二部分应用双向凝胶电泳技术对经过第一部分基因突变分型确认的高、低危型GISTs组织总蛋白质表达谱进行对比分忻,发现41个表达差异至少2倍的蛋白质斑点;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MAI—Dl—TOF—MS)技术对差异蛋白质点进行质谱分忻,成功鉴定了27种不同分子特性的蛋白质。其中,14种蛋白质包括ALDHlA2、LIO.C:Rcl、ccT一2、PDI-IB、PRDX3、Prohibitin、Pa28B、cOX5A、CLPP、TuFM、GST01、HcRTRl、NM23一H1及未知蛋白等在高危型GISTs组织中上调表达,13种蛋白质包括APOAl、Haptoglobin、HEBPl、clorfl23、HSPB6、sH3BGRI.、GSTM2、TPMl、PDIA3、DDAtll、TTcl、HNRNPC:及DJ-1等在高危型GISTs组织中表达减弱或缺夫。本研究第三部分应用多个在线生物信息学工具对第二部分实验获得的差异表达蛋白分子进行细胞和染色体定位、分子生物学功能以及信号转导等在线分忻,进一步揭示差异表达蛋白的总体分子特征。我们发现76%差异蛋白分布于细胞内,其中,胞浆蛋白比例最大(45%)、其次线粒体蛋白(23%),此外还包括核蛋白和细胞骨架蛋白。差异蛋白对应基因的染色体广泛分布于1号、3号、5号、10号、11号、12号、14号、15号、16号、17号、19号和x染色体上,而以染色体1p和15q最集中(35%),分别包括5种蛋白(clorfl23、GSTM2、DDAHl、DJ-1和HcRTRl)和4种蛋白(ALDHlA2、TPMl、PDIA3和cOX5A)。生物学功能分忻发现,这些差异蛋白具有多样性生物学功能,包括基因转录、翻译调控(31%)、细胞增殖(11.5%)、细胞凋亡(11.5%)以及G蛋白偶联受体信号通路(11.5%)等。最后,我们通过KEGG信号通路分忻,发现这些蛋白所参与的信号转导通路也极其广泛,包括抗原处理和呈递、蛋白酶体水解、RNA剪接、氧化磷酸化、PPAR信号转导通路等途径。本研究第四部分进一步在对质谱鉴定、生物信息学挖掘及文献搜寻等进行综合分忻后,重点选择差异蛋白PRDX3和Prohbitin通过构建组织微阵列,应用免疫组化方法进行验证。分忻PRDX3和Prohbitin与GISTs临床病理参数的关系,结合随访数据分忻PRDX3和P rohbitin在GISTs予页后判定及转移予页警的意义。结果发现,PRDX3蛋白过表达仅与KIT阳性GISTs的起源部位(x2=11.362,P=O.023)、核分裂像(x2=4.740,P=O.029)及危险度分层(x2=6.370,P=O.035)密切相关;PRDX3蛋白过表达GISTs患者的远期予页后较差(HR=2.564,95%CI 1.325-4.960,P=O.005)。而P rohibitin过表达则与KIT阳性GISTs患者性别(x2=3.883,P=O.049)、起源部位(X2=28.900,P=O.ooo)、瘤灶大小(x2=9.896,P=O.019)、核分裂像(x2=13.086,P=O.000)及危险度分层(x2=13.740,P=O.001)等存在相关关系;Prohbitin蛋白过表达是影响GISTs患者远期予页后的不良因素(HR=2.120,95%CI 1.146-3.919,P=O.ooo)。PRDX3和P rohbitin过表达对GISTs的予页后判定和转移予页警具有一定的参考价值。