第一部分　　 深入解构保守的谷氨酰胺残基对PDE9A抑制剂选择性和底物特异性的影响　　 --蛋白质晶体结构、定向突变及分子动力学模拟研究　　 环核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)能特异性地以3’,5’-环核苷酸为底物,可以通过催化水解cAMP和/或cGMP生成相应的无活性的AMP和/或GMP而控制其在细胞内的浓度,从而影响多种生理过程和代谢功能。所有PDE蛋白活性部位都有一个绝对保守的谷氨酰胺残基。这个残基在PDE的催化活性中发挥关键作用,但其是否在识别仅存在细微差别的cAMP和cGMP方面起决定性的作用仍有争议。　　 我们在PDE9A中保守的谷氨酰胺残基(Gln453)突变为谷氨酸,对该谷氨酰胺残基侧链构象起稳定作用的谷氨酸残基(Glu406)突变为丙氨酸,并对突变蛋白进行了晶体学研究、酶动力学测定和分子动力学模拟。突变蛋白的酶促反应动力学测定结果表明,Q453E突变导致PDE9A蛋白对cGMP的亲和力下降了约25倍,而对cAMP的亲和力基本保持在同一水平。PDE9A(Q453E)/S-Bay73-6691复合物晶体结构及PDE9A(Q453E)/IBMX复合物晶体结构显示,Q453E突变没有导致Glu453残基侧链构象的显著变化,但导致底物结合部位局部微环境的变化。分子动力学模拟结果证实了此由Q453E突变导致的局部微环境的变化。此外,酶动力学测定结果表明,Q453E突变在不同程度上影响不同抑制剂的结合,其对PDE9A选择性抑制剂及Bay73-6691抑制活性的影响远远大于对非选择性抑制剂IBMX和PDE5/6抑制剂Zaprinast的影响。酶促反应动力学结果也表明,E406A突变仅导致PDE9A蛋白对底物和抑制剂的亲和力发生轻微变化。　　 本研究结果表明,保守的谷氨酰胺残基对底物/抑制剂的结合发挥了关键性的作用,但该残基并不能决定PDE9A蛋白的底物特异性和抑制剂选择性。本研究的结果将有助于新的高选择性PDE9A抑制剂的设计。　　 第二部分　　 PDE9A与一种新型抑制剂复合物的晶体结构和酶动力学研究　　 选择性PDE9A抑制剂可用于治疗糖尿病、阿尔茨海默氏症等疾病。目前已有的PDE9A抑制剂普遍存在选择性不够高、副作用较强的问题。本研究组根据PDE9A与抑制剂Bay73-6691复合物晶体结构及定向突变蛋白的酶促反应动力学信息,设计并合成了一系列新的选择性PDE9A抑制剂,其中最好的一个抑制剂LW-AO的抑制活性(42 nM)明显高于Bay73-6691(92nM),而对其他亚型PDE蛋白的选择性较高。PDE9A与这种抑制剂复合物的晶体结构表明,抑制剂与PDE9A蛋白底物结合部位氨基酸残基之间的相互作用是导致该抑制剂高活性和高选择性的结构基础。