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目的: 研究CYR61对dNK细胞分泌VEGF-C及其对HTR-8/SVneo滋养细胞侵入功能的影响,探讨CYR61在胎盘血管形成及子痫前期发病过程中的作用。 方法: 1.无菌获取早孕期(7~9周)底蜕膜组织,充分剪碎(~1mm3),胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化,获得单细胞悬液;阴性磁珠分选法(德国美天旎)获得CD56+ dNK细胞;流式细胞仪鉴定dNK纯度,备用。 2.dNK培养基中,添加不同浓度CYR61,刺激培养48小时,实时荧光定量(realtime-PCR)法检测dNK细胞中VEGF-C mRNA的变化情况;ELISA法检测上清中VEGF-C蛋白含量变化。 3.细胞免疫荧光法检测dNK细胞αVβ3表达。 4.利用αVβ3单克隆抗体LM609阻断dNK表面αVβ3,然后添加CYR61刺激培养,确定CYR61是否是通过与dNK细胞αVβ3受体结合,影响其分泌VEGF-C的功能。 5.dNK培养基中预先加入PI3K-AKT特异性阻断剂LY294002,然后再进行CYR61刺激培养,分析CYR61促进dNK细胞分泌VEGF-C的细胞内信号通路。 6.利用细胞划痕试验,观察dNK条件培养基(CYR61刺激培养48小时后)对HTR-8/SVneo滋养细胞迁移能力的影响,探讨CYR61作用于dNK后,对胎盘滋养细胞迁移能力的影响。 7.CYR61刺激培养HTR-8/SVneo滋养细胞24小时,检测其NUR77 mRNA及蛋白水平的变化。 8.分别用realtime-PCR及westernblot法检测子痫前期患者及正常胎盘NUR77mRNA及蛋白表达水平差异。 9.免疫组化法检测NUR77在子痫前期患者胎盘、正常胎盘及早孕期(7~8周)绒毛中的表达水平及细胞定位。 10.加入外源性CYR61或者含有人NUR77全长cDNA序列的腺病毒(Ad-nur77),利用细胞划痕试验观察其对HTR-8/SVneo滋养细胞迁移能力的影响;同时加入NUR77干扰腺病毒(Ad-sinur77),观察Ad-sinur77能否阻断这一过程。 11.加入外源性CYR61或者含有人NUR77全长cDNA序列的腺病毒(Ad-nur77),利用Transwell(包被Metrigel胶)试验观察其对HTR-8/SVneo滋养细胞侵蚀能力的影响,同样加入Ad-sinur77,观察能否阻断这一过程。 12.分别加入不同浓度的CYR61或者Ad-nur77刺激培养HTR-8/SVneo滋养细胞,利用凝胶酶谱实验,检查上清中基质金属蛋白酶MMP2、MMP9含量变化;利用realtime-PCR法检查HTR-8/SVneo滋养细胞MMP2及其特异性组织阻断物TIMP2 mRNA的表达变化;加入Ad-sinur77观察其能否阻断上述变化。 结果: 1.分离得到纯化dNK细胞,流式细胞仪检测其纯度>95%。 2.Realtime-PCR及ELISA结果显示,随着CYR61浓度的增加,dNK细胞中VEGF-C mRNA表达量,上清中VEGF-C蛋白含量均呈现增加趋势。 3.免疫荧光的结果显示,dNK细胞表面表达αVβ3整合素受体。 4.加入αVβ3封闭性抗体LM609后,可以部分阻断CYR61促进dNK分泌VEGF-C的作用。 5.LY294002可以部分抑制CYR61促dNK细胞分泌VEGF-C的作用。 6.dNK条件培养基可以促进HTR-8/SVneo滋养细胞迁移。 7.CYR61显著上调HTR-8/SVneo滋养细胞NUR77 mRNA及蛋白表达。 8.与正常胎盘相比,子痫前期患者胎盘NUR77 mRNA及蛋白表达水平显著下降。 9.NUR77蛋白主要表达于滋养细胞,与正常足月妊娠胎盘相比,子痫前期患者胎盘NUR77表达显著下降,尤其是在绒毛外滋养细胞。同时,NUR77在早孕期绒毛滋养细胞的表达显著高于晚孕期胎盘。 结论: CYR61调控dNK细胞分泌VEGF-C; CYR61促进HTR-8/SVneo迁移及侵蚀能力;CYR61对母胎界面的两种关键细胞(dNK、滋养细胞)均有重要的调节作用,因此可能在胎盘发育和植入过程中发挥着重要的作用;CYR61表达的降低,可能与PE发病相关。