胰岛素抵抗和胰岛素分泌功能下降是2型糖尿病的两个中心环节，不管是否存在胰岛素抵抗，在确诊2型糖尿病时，胰岛β细胞的功能只有正常人的50％，而且随着血糖的升高逐渐恶化。即胰岛不能分泌足够的胰岛素满足机体的代谢需求是发生糖尿病的关键。而胰岛β细胞减少是胰岛素分泌缺陷的病理基础。虽然50年前已经提出这个假设，但由于检测手段的限制，近几年才逐渐在动物和人体上得到证实：在非糖尿病的肥胖个体，胰岛β细胞出现代偿性的肥大和增生，整个胰岛β细胞数目增加、体积增大，伴随胰岛素分泌的增加。在2型糖尿病个体则出现胰岛β细胞凋亡增多、细胞总数下降以及出现淀粉样物质沉积的现象，同时伴随胰岛素分泌的下降。目前认为胰岛β功能下降以及细胞凋亡与葡萄糖毒性、脂毒性、炎症因子增多、胰淀素沉积等因素有关。脂毒性(lipotoxicity)是指游离脂肪酸(FFA)引起的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能损害以及β细胞凋亡，又称“脂性凋亡”(lipoapoptosis)，但其作用机制尚未明了。 新近发现的胰岛细胞特异的微小RNA—375(miR—375)对胰岛素分泌的调节作用，以及可能对细胞脂性凋亡的影响有助于认识胰岛素分泌异常和胰岛β细胞凋亡的机制。 miRNA是一组不编码蛋白的RNA，可以从转录后水平抑制蛋白的表达。最近几年研究表明miRNA的作用涉及了生物体的生长、发育、分化和死亡的全过程，然而，关于miRNA在胰岛素分泌和β细胞凋亡方面的调节的研究却屈指可数。2004年，一项重大研究发现miR—375通过抑制myotrophin(又称V1，Mtpn)参与调节胰岛素的胞吐作用。V1的生物学功能目前仅来自神经细胞、成纤维细胞和心肌细胞的研究结果。研究结果显示：V1的主要生理作用是促进细胞增生、分化，拮抗细胞凋亡。V1在胰岛细胞的生理作用除上述参与调节胰岛素分泌外，其它功能尚无研究。 综合miR—375、V1的生物学作用，以及胰岛素分泌异常和胰岛细胞凋亡是胰岛素分泌减少的主要原因，我们提出理论假设：miR—375和V1有可能通过调节胰岛素分泌和影响胰岛β细胞凋亡，参与2型糖尿病的发生发展。 研究目的： 改变内源性miR—375水平是否影响β细胞的脂性凋亡，并探讨可能机制。 研究内容： (1)检测NIT-1细胞株是否有V1蛋白表达，以及游离脂肪酸(棕榈酸)诱导凋亡时是否导致V1表达的变化。 (2)转染miR—375，提高内源性miR—375的水平，观察其对小鼠胰岛β细胞NIT-1脂性凋亡以及V1表达水平的影响。 (3)转染miR—375反义寡核苷酸链(2—O—me—375)，降低内源性miR—375的水平，观察其对小鼠胰岛β细胞脂性凋亡以及V1表达水平的影响。 研究方法： 1.细胞培养 实验采用小鼠胰岛素分泌细胞系NIT-1细胞(20-40代)，培养基为含10mMHepes，10％胎牛血清，1％青—链霉素混合液的DMEM低糖培养基，在37℃含5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，每2-3天换液一次，4-5天传代一次。 2.构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞脂性凋亡模型和检测V1表达水平 实验分为对照组(含等量无水乙醇)、棕榈酸组(500 umol/L)，培养48h后，依次行Hochest33342染色、TUNEL检测凋亡。同时Western blot检测V1表达水平。 3.优化转染条件 在2 ml转染体系，以转染脂质体lipo20005ul，转染0，12，25，40，60，80nmol/L等各浓度的miRNA.分组：转染NC—FAM(荧光标记的阴性miRNA)检测转染率，转染2—O—me—375检测提高V1表达倍数，转染miR—375检测V1表达抑制率，以荧光显微镜和流式细胞仪计数检测转染率，以Western blot检测V1表达水平。 4.转染miR—375，检测胰岛细胞脂性凋亡和V1表达水平变化 将NIT-1细胞分为四组，空白组(正常培养的细胞)，空转组(等量转染脂质体)，阴性对照 miRNA转染组(等量转染脂质体+阴性对照miRNA)，miR—375转染组(等量转染脂质体+miR—375)。在2ml转染体系，通过转染脂质体5ul(空白组不加)，将80nM miR—375或阴性对照miRNA(空转组不加)转入NIT-1，72h后各组分别以棕榈酸(500 umol/L)培养48h。使用Hochest33342染色和TUNEL检测并计算凋亡率，Western blot检测V1表达水平。 5.转染2—O—me—375，检测胰岛细胞脂性凋亡和V1表达水平变化 将NIT-1细胞分为四组，空白组(正常培养的细胞)，空转组(等量转染试剂)、阴性对照miRNA转染组(等量转染脂质体+阴性对照miRNA)、2—O—me—375 RNA转染组(等量转染脂质体+2—O—me—375)。在2ml转染体系，通过转染脂质体5ul(空白组不加)，将80nM2—O—me—375或阴性对照miRNA(空转组不加)转入NIT-1，72h后分别予棕榈酸(500 umol/L)培养48h，依次行Hochest33342染色，TUNEL检测凋亡，同时Western blot检测V1蛋白表达水平。 6.统计学分析 实验数据采用SPSS11.5统计学软件进行分析，计量资料符合正态分布者用均数±标准差表示，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两之间比较用LSD，计量资料两组间比较采用t检验，P<0.05视为有统计学意义。 研究结论： 1.棕榈酸诱导胰岛细胞凋亡伴有V1表达水平下降。 2.miR—375参与调节小鼠胰岛β细胞的脂性凋亡，其可能机制与下调V1的表达相关。