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嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile CT2)是一种最适生长温度较高的极端微生物,其产生的纤维素酶在高温下可以保持优良的催化活性,此特性利于纤维素酶的工业应用。本研究以嗜热毛壳菌为研究对象,通过RT-PCR扩增出编码嗜热毛壳菌外切纤维二糖水解酶CBH3及内切葡聚糖酶EG2成熟肽的基因,利用毕赤酵母诱导表达体系分别对这两个蛋白进行了高效表达、纯化及性质研究;对外切纤维二糖水解酶CBH3进行同源建模,选定了5个氨基酸位点并且分别进行了定点突变,利用毕赤酵母表达体系同样对5个突变酶分别进行了高效表达、纯化及性质研究。酵母工程菌WTCBH3表达的CBH3酶,其蛋白分子量大小约为47kDa,最适反应温度为60℃,最适反应pH为5。该酶在70℃条件下保温1h后,剩余酶活力仍有最高酶活的80%,具有良好的热稳定性。CBH3在50℃~60℃时,酶活力保持在最高酶活的90%以上,但当反应温度高于65℃后,CBH3酶活力会随着温度的升高而迅速降低,当温度达到70℃时,剩余酶活力不足20%;酵母工程菌WTEG2表达的EG2酶,其蛋白分子量大小约为45kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH为5,该酶在70℃条件下保温1h后,剩余酶活力有70%。外切纤维二糖水解酶Cel7B与CBH3的氨基酸序列相似度达到80.65%,且Cel7B的空间三维结构已通过X射线衍射技术了解清楚,Cel7B各项参数符合同源建模的模板标准。将CBH3与Cel7B进行同源建模后,选定了CBH3上5个与底物结合相关的氨基酸位点为突变位点。通过定点突变的方法,将5个选定的氨基酸分别突变为丙氨酸后,进行酵母诱导表达、纯化、收集蛋白,测定纯化蛋白的酶学性质,期待筛选出CBH3结构域中底物结合区的关键氨基酸。对纯化的5个突变酶CBH3-246Y、CBH3-250R、CBH3-261D、CBH3-337D、CBH3-391R进行活性测定,5个突变酶的最适温度均为60℃,最适pH均为5。5个突变酶的酶活力与原酶CBH3相比都产生了不同程度的降低,其中突变体CBH3-391R的酶活力降低了约60%;突变体CBH3-246Y、CBH3-261D、CBH3-337D的酶活力均降低了25%以上。在反应温度为40℃时,除CBH3-250R外,其它四个突变酶活力均降低到最高酶活的30%以下。根据实验结果可以推断出,CBH3氨基酸序列中第246位的酪氨酸、第261位的天冬氨酸、第337位的天冬氨酸、第391位的精氨酸都是CBH3催化反应过程中与底物结合相关的重要氨基酸,其中第391位的精氨酸的突变对酶分子的活性影响最大。