牙周炎是牙周支持组织的慢性感染性疾病，是我国成年人失牙的主要原因。菌斑细菌是牙周炎的始动因子，其中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)是证据充分的致病菌，目前被认为是毒力最强的牙周致病菌之一。　　 当病原微生物感染某一宿主后，常采取一系列策略操控宿主细胞的功能，通过某些细胞因子的合成和分泌减少、抑制细胞凋亡、干扰细胞增殖周期等机制导致该细胞功能紊乱，以利于自身生存。近期学者发现牙龈卟啉单胞菌如同许多病毒能够干扰宿主细胞周期以配合其复制一样，对宿主细胞的细胞周期也有类似的作用。研究表明P.gingivalis感染人胎盘滋养母细胞、人成软骨细胞，内化的P.gingivalis能抑制细胞增殖，诱导细胞停滞于G1期同时伴随着细胞凋亡。然而，P.gingivalis对牙龈上皮细胞的作用却相反，Kuboniwa M等通过基因芯片方法发现P.gingivalis内化牙龈上皮细胞通过调节细胞周期蛋白、p53和PI3K等，提高牙龈上皮细胞的增殖率，加速细胞周期进程，并且这种能力依赖细菌的菌毛，细胞周期的加速为细菌复制和定植创造条件。　　 细胞周期是一个高度有序的运转过程，细胞在细胞周期中依次经历G1期、S期、G2期、M期，完成其增殖过程。一般来说，不同生物、不同组织以及机体发育的不同阶段，细胞周期的长度差异很大，而细胞周期时间的差异主要取决于G1期的长短。细胞周期调控核心是CDKs-Cyclins-CKIs网络。其中CDKs是此系统的中心，Cyclins起着正性调控的作用，而CKIs为负性调控因子，正负调控因子之间稳定协调的关系对维持细胞周期的正常进程至关重要，如果二者之间的均衡被打破，则不可避免的会带来细胞周期的紊乱。调节G1期向S期过渡的Cyclins-CDKs复合物有2种，Cyclin D家族激活CDK4/6，Cyclin E家族激活CDK2。　　 目前研究和早期的一些报道表明牙龈卟啉单胞菌至少可以通过JAK/STAT和PI3K/Akt两条主要信号通路抑制牙龈上皮细胞的凋亡。细胞周期与细胞凋亡是相互关联的，阻断细胞增殖周期进程可引起细胞凋亡，而抑制凋亡常常伴随细胞周期的加速，细胞增殖周期和凋亡密切相关。一些关键的细胞周期调控蛋白也参与细胞凋亡的调节，两者之间存在协同作用。研究表明JAK/STAT信号传导途径的激活，特别是STAT3的活化，能够激活c-Fos，c-myc、Cyclin D1、Survivin和bcl-xl等下游靶基因，诱导关键产物的表达从而促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，参与肿瘤的发生和演进。同时，研究结果显示Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡的重要因子。近年来牙龈卟啉单胞菌影响牙龈上皮细胞周期的机制虽然引起研究者的关注，但是鲜有研究报道。本研究通过建立P.gingivalis内化牙龈上皮细胞的模型，采用JAK/STAT信号通路的抑制剂AG490，观察细胞内Survivin、CyclinD、Cyclin E的变化，探讨JAK/STAT在牙龈卟啉单胞菌内化牙龈上皮细胞加速细胞周期进程中的作用。　　 在牙周炎症发生过程中，牙龈上皮细胞是宿主牙周组织防御机制的第一道天然屏障。P.gingivalis及其产物与牙龈上皮细胞之间的相互作用是P.gingivalis感染牙周组织至关重要的一步，因此，本课题通过探讨牙龈卟啉单胞菌加速牙龈上皮细胞周期的机制，对理解牙周炎的发生、发展有重要意义。　　 材料和方法　　 一、实验菌株和细胞株本次研究采用了2种菌株:P.gingivalis ATCC33277、P.gingivalis W83。P.gingivalis W83由美国佛罗里达大学牙科学院口腔生物研究所Lamont RJ教授惠赠，P.gingivalis ATCC33277由中国医科大学口腔生物教研室提供。　　 本实验采用的永生化人类牙龈上皮细胞（immortalized human gingivalepithelial cells，IHGE细胞）由日本大阪大学齿学部牙周病学科Murakami教授惠赠。　　 二、试剂和仪器（一）仪器设备厌氧培养箱（LY-Ⅰ型，沈阳医疗器械研究所，中国）　　 紫外分光光度计（752N，上海精密科技公司，中国）　　 酶标仪（Tecan，奥地利）　　 流式细胞仪（BD，美国）　　 酶标仪（Tecan，奥地利）　　 RealTime PCR扩增仪(ABI7500，美国)荧光显微镜（尼康，日本）　　 垂直电泳仪及电转移槽（美国Bio-Rad公司）　　 （二）试剂和药品角化细胞特异性培养液（HuMedia KG2，日本）　　 鼠抗人CyclinE（Santa cruz biotechnology，美国）　　 鼠抗人STAT3（Santa cruz biotechnology，美国）　　 鼠抗人p-STAT3（Santa cruz biotechnology，美国）　　 鼠抗人Survivin（Santa cruz biotechnology，美国）　　 AG490（Sigma，美国）　　 溴化丙啶（Sigma，美国）　　 RNA酶（Sigma，美国）　　 SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒(Takara，中国)三、实验方法（一）菌株的培养和计数P.gingivalis ATCC33277和P.gingivalis W83菌株接种于新鲜配制的含5％无菌脱纤维羊血，1％氯化血红素和0.1％维生素K1的脑心浸液琼脂培养基中，37℃厌氧(80％N2，10％H2，10％CO2)培养5-7天传代。液体培养24h后，6000×g4℃离心10min收集细菌，PBS洗涤一次，重悬于无抗生素细胞培养基中。使用紫外分光光度计测量OD600，计算细菌的浓度备用。　　 （二）细胞培养牙龈上皮细胞培养于角化细胞特异性培养液(HuMedia KG2)中，其中加入0.5μg/ml氢化可的松，10μg/ml胰岛素，0.4％V/V牛垂体提取物，0.1ng/ml人上皮生长因子，50μg/ml庆大霉素和50ng/ml两性霉素B，在饱和湿度的环境中(5％CO2，37℃)培养。实验前饥饿24h，采用血细胞计数板在光学显微镜下计数细胞后用于侵入分析。　　 （三）建立P.gingivais内化IHGE细胞的模型P.gingivalis ATCC33277和W83分别与IHGE细胞共同培养2h后，换液洗去细胞外未黏附细菌，换成含300μg/ml庆大霉素和200μg/ml甲硝唑的新鲜培养液再继续培养，设立仅加入培养基组为对照组。　　 （四）MTT比色法检测P.gingivalis内化IHGE细胞增殖活性MOI分别为50、100、500、800∶1，建立P.gingivalis内化IHGE细胞的模型，设立仅加入培养基为空白对照组，加入细胞和培养基为对照组，P.gingivalis内化时间分别达4h、6h、8h、10h、12h、24h，加入MTT(20μl/孔)溶液，继续培养4h，弃去各孔中的液体再加入二甲基亚砜（150μl/孔），将培养板置于微孔板震荡器上避光振荡10min，酶标仪检测各孔OD490值。　　 （五）抗生素保护法检测P.gingivalis对IHGE细胞的侵入效率MOI为100∶1，P.gingivalis ATCC33277和W83分别与IHGE细胞共同培养2h，换液洗去细胞外未黏附细菌，换成含300μg/ml庆大霉素和200μg/ml甲硝唑的新鲜培养液继续培养1h，PBS洗涤3次，加入1ml无菌的蒸馏水裂解1h。取100μl裂解液接种于新鲜配制脑心浸液琼脂培养基中，37℃厌氧培养7天。计数菌落数，计算P.gingivalis对IHGE细胞的侵入效率。　　 （六）流式细胞术检测P.gingivalis内化IHGE细胞周期的分布MOI为100∶1，建立P.gingivalis内化IHGE细胞的模型，P.gingivalis内化时间分别达6h、10h、12h，收集IHGE细胞，加入预冷70％冰乙醇，4℃固定过夜。加入含溴化丙啶(50μg/ml)和RNA酶(100μg/ml)的染液500μl，避光30min，流式细胞仪检测细胞周期分布。　　 （七）qRT-PCR检测P.gingivalis内化IHGE细胞STAT3、Survivin、 Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2 mRNA的表达MOI为100∶1，建立P.gingivalis内化IHGE细胞的模型，P.gingivalis内化时间分别达4h、6h、10h、12h。RNA-plus处理细胞，提取细胞总RNA，进行反转录，使用热循环仪和SYBRGreen试剂检测STAT3、Survivin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2mRNA的表达。　　 （八）Western bolt检测P.gingivalis内化IHGE细胞STAT3、p-STAT3、Survivin、Cyclin E蛋白的表达MOI为100∶1，建立P.gingivalis内化IHGE细胞的模型，P.gingivalis内化时间分别达4h、6h、10h、12h。收集细胞，制备蛋白提取液，蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转印于PVDF膜上，与STAT3、p-STAT3、Survivin、Cyclin E抗体及辣根过氧化物酶标记的二次抗体杂交后显影成像。　　 （九）流式细胞术检测P.gingivalis内化IHGE细胞Cyclin E蛋白的荧光率MOI为100∶1，P.gingivalis内化IHGE细胞10h后，甲醇固定，Triton-100裂解细胞，非特异血清封闭，加入Cyclin E抗体过夜，FITC荧光标记二抗孵育，流式细胞仪上机检测。　　 （十）荧光显微镜检测P.gingivalis内化IHGE细胞STAT3蛋白细胞内定位常规制备细胞爬片，MOI为100∶1，P.gingivalis内化IHGE细胞4h后，戊二醛固定，Triton-100裂解细胞，非特异血清封闭，加入STAT3抗体过夜，FITC荧光标记的二抗杂交，DAPI染色液，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜检测。　　 （十一）统计学分析应用统计学软件SPSS11.0进行统计学分析。对于计量资料数据呈正态分布时，均数用mean±SD表示，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用方差分析;数据呈非正态分布时，均数用中位数表示，组间比较采用秩和检验。计数资料比较采用X2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 一、MTT比色法检测P.gingivalis内化IHGE细胞增殖活性P.gingivalis内化IHGE细胞4至6h，细胞增殖未见明显的变化;高感染复数500∶1、800∶1，P.gingivalis内化IHGE细胞8至24h，细胞增殖受到明显的抑制，并且有浓度和时间的依赖性，感染复数越高对细胞增殖的抑制作用越强;感染复数500∶1、800∶1时，P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞间在10h、12h两个时间点，两组细胞增殖有显著性差异，W83菌株抑制作用更强;感染复数100∶1时，P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞在10至12h能够促进细胞的增殖;低感染复数50∶1、100∶1时，比较P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞，在10h、24h两个时间点两组间细胞增殖的差异有统计学意义。　　 二、P.gingivalis对IHGE细胞的侵入效率P.gingivalis ATCC33277的侵入效率为7.27±2.28CFU/cell，P.gingivalis W83的侵入效率为2.25±1.13CFU/cell，P.gingivalis ATCC33277的侵入效率约是P.gingivalis W83的3倍，两组间有统计学差异。　　 三、P.gingivalis内化IHGE细胞周期的分布P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞6至12h G1期细胞比例明显减少，S期细胞比例增高，而对照组在6至12h G1期细胞比例变化不大。P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞后10h和12h两个时间点，G1期和S期细胞比例与对照组相比差异有统计学意义。P.gingivalis W83与ATCC33277菌株诱导细胞周期变化的能力无差异。AG490预处理牙龈上皮细胞阻断STAT3通路后，G1期细胞比例下降，抑制率约为66.67％。　　 四、P.gingivalis内化IHGE细胞STAT3 mRNA和蛋白的表达MOI为100∶1，P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞4h检测STAT3 mRNA表达水平约为对照组的3倍，以后随时间的延长而逐渐下降，12h回到基线。P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞，两组间STAT3 mRNA表达无明显差异。　　 MOI为100∶1，P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞4h总STAT3和p-STAT3蛋白表达水平均增高，p-STAT3增高更加明显，而后逐渐下降，12h回到基础水平，P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞，两组间总STAT3和p-STAT3蛋白表达无明显的差异。　　 五、P.gingivalis内化IHGE细胞Su rvivin mRNA和蛋白的表达MOI为100∶1，P.gingivalis ATCC33277菌株内化IHGE细胞4h，SurvivinmRNA和蛋白表达量约是对照组的3倍。抑制剂AG490预处理阻断STAT3信号通路后，P.gingivalis ATCC33277菌株内化IHGE细胞Survivin mRNA和蛋白表达下降，但仍达到对照组的2.3倍，三组间的差异有统计学意义，而后随时间延长，表达逐渐下降，12h时回到基线水平。　　 六、P.gingivalis内化IHGE细胞Cyclin D1 mRNA的表达MOI为100∶1，P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞Cyclin D1mRNA在4h时表达与对照组没有差异，但是，6h时CyclinD1 mRNA表达开始升高，在10h和12h两个时间点表达量约是对照组的1.5倍。P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞，两组间Cyclin D1 mRNA表达差异没有统计学意义。加入抑制剂阻断STAT3通路后，P.gingivalis ATCC33277菌株内化IHGE细胞Cyclin D1 mRNA的表达水平下降，但与对照组相比差异有统计学意义。　　 五、P.gingivalis内化IHGE细胞Cyclin E1 mRNA和Cyclin E蛋白的表达MOI为100∶1，P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞Cyclin E1mRNA和Cyclin E蛋白在4至6h表达与对照组没有差异，在10至12h两个时间点Cyclin E1 mRNA和Cyclin E蛋白表达水平明显高于对照组。P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞，两组间Cyclin E1 mRNA和Cyclin E蛋白表达差异没有统计学意义。加入抑制剂阻断STAT3通路后，P.gingivalis ATCC33277菌株内化IHGE细胞Cyclin E1 mRNA和Cyclin E蛋白的表达水平下降，但与对照组相比差异有统计学意义。　　 六、P.gingivalis内化IHGE细胞Cyclin E蛋白的荧光率。　　 P.gingivalis内化IHGE细胞10h，Cyclin E蛋白在对照组阳性率45.08％，P.gingivalis ATCC33277菌株内化组阳性率73.35％，W83菌株内化组阳性率69.82％，P.gingivalis内化IHGE细胞Cyclin E蛋白的阳性表达率明显高于对照组。　　 七、P.gingivalis内化IHGE细胞STAT3蛋白细胞内定位。　　 P.gingivalis ATCC33277菌株内化IHGE细胞4h STAT3被激活，由细胞浆移入细胞核。　　 结论：　　 1、P.gingivalis ATCC33277和W83菌株能够侵入IHGE细胞。　　 2、不同感染复数P.gingivalis内化IHGE细胞对细胞增殖不一致。高感染复数500∶1、800∶1时，P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞8至24h，细胞增殖受到明显的抑制，并且有浓度和时间的依赖性。高感染复数时，P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞在10h和12h抑制细胞增殖，W83菌株抑制作用更强，两组间差异有统计学意义;低感染复数时，P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞在10h和12h却能够促进细胞的增殖。低感染复数时，P.gingivalis ATCC33277与W83菌株内化IHGE细胞在10h和24h时，两组间细胞增殖的差异有统计学意义。　　 3、P.gingivalis在内化10h、12h两个时间点，能够促进牙龈上皮细胞G1/S期的转换，缩短G1期的进程，促进细胞的增殖。　　 4、P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化IHGE细胞6h时，Cyclin D1 mRNA表达增高，内化10h时Cyclin E1 mRNA和Cyclin E蛋白表达上调，提示P.gingivalis内化IHGE细胞Cyclin D、Cyclin E提前表达和高表达，促进细胞增殖，加速细胞G1/S期转换。　　 5、P.gingivalis ATCC33277和W83菌株内化牙龈上皮细胞4h时STAT3 mRNA表达上升，总STAT3蛋白和p-STAT3蛋白都明显增高，提示P.gingivalis内化牙龈上皮细胞通过激活STAT3，促进细胞增殖。　　 6、采用AG490阻断STAT3信号通路后，部分阻断P.gingivalis ATCC33277菌株内化IHGE细胞对细胞周期的推动作用，同时细胞内Survivin、Cyclin D、CyclinE的表达水平降低，提示JAK/STAT信号通路参与P.gingivalis内化IHGE细胞促进细胞增殖的作用，但仍有其它信号通路参与其作用。