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脑胶质瘤的治疗仍是目前神经外科学界的难题之一。尽管近些年来在手术、放疗、化疗等方面不断取得进步,然而几十年来胶质瘤的平均生存期并没有明显改观。分子生物学、遗传学的进步促进了恶性胶质瘤基因治疗的发展。在众多的在研基因中白细胞介素24(interleukin-24,IL-24)越来越受到广泛关注,IL-24属于白介素10细胞因子家族,因最初被发现在终末分化的人类黑色素瘤中高度表达,也被称为黑色素瘤分化相关因子-7(mda-7)基因。
研究证实IL-24对肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种癌细胞均有选择性的抑制作用。进一步的研究发现,将IL-24基因转染人非小细胞肺癌的细胞后,肿瘤细胞对放射治疗的敏感性得到明显增强；将IL-24基因转染入人乳腺癌细胞,可明显增强肿瘤细胞放、化疗的治疗作用。
在本研究中我们用新型重组腺病毒作载体携带IL-24基因(Ad5F35-IL24),分别转染体外的人胶质瘤细胞系U251和在体的人胶质瘤组织,观察IL-24基因对胶质瘤细胞的影响以及IL-24与放射治疗联合应用是否相互协同增效,并探讨其可能的作用机制。
第一部分
目的:观察IL-24基因对裸鼠在体人胶质瘤的生长是否存在抑制作用,并初步探讨其作用机制。
方法:建立人胶质瘤U251的动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤的生长情况。通过Western Blot方法检测肿瘤组织中IL-24蛋白、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况；通过原位缺口末端标记技术检测肿瘤组织的凋亡情况；通过免疫组织化学染色检测肿瘤组织的血管密度,以及bFGF、VEGF的表达情况。
结果:Ad5F35-IL24转染U251胶质瘤后IL-24蛋白高度表达,统计学分析显示实验组肿瘤组织和对照组相比较:肿瘤的生长受到明显抑制(P<0.05)；其凋亡率明显升高(P<0.05)；Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01)；微血管生成明显减少(P<0.05)；VEGF和bFGF表达亦明显减少(P<0.05)。
结论:IL-24具有抑制胶质瘤生长的作用,诱导胶质瘤细胞凋亡和抑制胶质瘤微血管生成可能是其主要的作用机制。进一步的研究表明促凋亡蛋白Bax的上调和抗凋亡蛋白Bcl-2的下调可能是IL-24诱导胶质瘤细胞凋亡的作用机制；诱导胶质瘤组织中VEGF和bFGF表达的减少可能是IL-24抑制胶质瘤微血管生成的作用机制。
第二部分
目的:探讨放射性粒子125I在动物体内抗人胶质瘤的效果及其作用机制。
方法:建立人胶质瘤U251的动物模型,瘤内植入放射性粒子125I,观察肿瘤生长情况,在电镜下观察其超微结构的变化,采用原位缺口末端标记技术检测肿瘤组织的凋亡情况,流式细胞仪检测Bax、Bcl-2的表达,并应用免疫组织化学染色检测血管密度和VEGF、bFGF的表达。
结果:人胶质瘤细胞U251的动物模型成功完成,植入放射性粒子125I后,胶质瘤生长较对照组明显受到抑制,电镜下可呈现核碎裂,核染质边聚等细胞凋亡的形态特征,检测显示实验组肿瘤组织的Bax/Bcl-2(1.88±0.47)明显高于对照组(1.11±0.52),P<0.01；实验组肿瘤组织凋亡率的IHS评分(3.64±0.89)明显高于对照组(0.81±0.45),P<0.01；实验组肿瘤组织的微血管密度IHS评分(1.40±0.55)明显低于对照组(3.23±0.87),P<0.01；实验组肿瘤组织VEGF的IHS评分(1.58±0.55)明显低于对照组(4.19±0.45),P<0.01；实验组肿瘤组织bFGF的IHS评分(2.44±0.89)低于对照组(3.52±0.79),P<0.05。
结论:放射性粒子125I对在体人胶质瘤U251有明确的抑制作用,促进瘤细胞凋亡和降低瘤组织微血管密度是其主要作用机制。
第三部分
目的:分别观察体外IL-24与X射线,体内IL-24与放射性粒子125I联合应用是否可协同抑制胶质瘤生长,并探讨其可能的作用机制。
方法:用Ad5F35-IL24和X射线分别或联合干预体外的U251细胞系,通过MTT法检测各组的抑制率,通过Hochest33258法检测各组的凋亡率,通过流式细胞仪检测各组的Bcl-2和Bax蛋白的表达情况,通过WesternBlot分析各组U251细胞的IL-24、PKR、p-PKR、p38-MAPK、p-p38-MAPK、Bcl-2、Bax蛋白表达水平；用Ad5F35-IL24与放射性粒子125I分别或联合干预在体的胶质瘤组织,通过TUNEL法测定各组肿瘤组织的凋亡情况,通过流式细胞仪检测各组肿瘤组织的Bcl-2和Bax蛋白的表达情况,通过免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织的血管密度,以及各组肿瘤组织bFGF、VEGF的表达情况。
结果:体外实验发现联合干预组U251细胞的抑制率和凋亡率均明显增高(P<0.001),Bax/Bcl-2升高(P<0.05),PKR、p38MAPK蛋白的表达和活化都明显增高(P<0.001)；体内实验结果同样证实同其余各组相比:联合干预组肿瘤组织的凋亡率明显增高(P<0.001),Bax/Bcl-2明显升高(P<0.05),PKR、p38MAPK蛋白的表达和活化都明显增高(P<0.001)。同时还发现发现联合干预组的微血管生成较其余组明显减少(P<0.05),VEGF和bFGF的表达也明显减少(P<0.05)。
结论:无论在体内外,IL-24和放射治疗对U251胶质瘤细胞均具有协同杀伤作用,推测其机制可能是通过使Bax/Bcl-2升高而诱导了U251胶质瘤细胞的凋亡。此外,联合治疗还可协同抑制胶质瘤组织中VEGF和bFGF表达,从而抑制胶质瘤微血管生成,进而抑制肿瘤增殖。IL-24和放射治疗联合应用,为胶质瘤的综合治疗提供了新思路。