研究背景和目的:肝癌是全世界范围内第六大常见的恶性肿瘤和第三大癌症相关致死病因。肝细胞肝癌是成年人最常见的肝脏恶性肿瘤。目前肝癌高致死率的主要原因是缺乏有效的治疗手段，对于早期肝癌缺乏明确的筛选指标。肝癌的预后往往较差，尽管经过手术、放疗、化疗、介入手段等治疗后，肝癌的5年生存率仅有约7%。对于进展期肝癌，有效治疗手段的缺乏促使人们不断探索新的治疗策略。关于肿瘤细胞增殖、分化、血管发生、侵袭、转移的癌基因及信号通路研究给我们指出了一些可能的治疗靶点，促进了分子靶向治疗的发展。细胞维甲酸绑定蛋白2(Cellular Retinoic Acid Binding Protein2,CRABP2)是一种细胞脂质绑定蛋白，与维甲酸RA的转运相关。CRABP2在细胞质中与RA结合，转运其入核后使维甲酸在细胞核中与其受体RARs相互作用以调节各种生理作用，如胚胎发生、凋亡、细胞增殖、分化等。CRABP2在癌症的发展过程中起着重要的作用。它的表达与功能在多种癌症中有文献报道，如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈肿瘤、肾母细胞瘤等。HCCLM3是一种人肝癌转移细胞株，具有较高的转移潜能，由复旦大学附属中山医院肝癌研究所建系。前期实验发现经由RNA和蛋白检测，CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的表达量均高于非转移性肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2。既往研究证实CRABP2与癌症病人的生存及预后有着一定联系。关于CRABP2是否能够影响转移性肝癌细胞HCCLM3的恶性生物学特性，目前尚无相关报道，因此在本研究中，我们探讨了CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的生物学作用及可能的机制，以期明确CRABP2是否能作为肝癌基因治疗的一个新的治疗靶点。方法:1.采用Real Time-PCR和Western Blot检测肝癌细胞（HCCLM3、Huh7、Hep3B、HepG2）和人肝细胞L02中CRABP2的mRNA和蛋白的表达。2.免疫组化方法检测人肝癌和癌旁的组织芯片，比较CRABP2在肝癌组织与癌旁组织的表达。3.设计并合成针对CRABP2基因的siRNA，分别在siRNA干扰HCCLM3细胞48h和72h后提取RNA和蛋白质，通过Real time PCR和Western Blot检测干扰效率。4. CCK-8法检测siRNA干扰CRABP2对HCCLM3细胞体外增殖的影响；流式细胞仪检测siRNA干扰CRABP2对HCCLM3细胞凋亡和周期的影响；使用BD公司生产的8μm孔径的24孔板用培养小室检测siRNA干扰CRABP2后HCCLM3细胞的体外迁移和侵袭能力变化。5.构建CRABP2shRNA稳定干扰逆转录病毒载体及阴性对照载体并稳定感染肝癌细胞株HCCLM3：利用逆转录病毒载体pMKO.1构建出干扰CRABP2的pMKO.1-CRABP2shRNA，选用293T细胞进行病毒包装，将病毒载体感染HCCLM3细胞，通过测序和western blot检测，建立起稳定的CRABP2基因shRNA干扰HCCLM3细胞株。6.构建CRABP2慢病毒过表达载体并稳定感染肝癌细胞株HCCLM3：利用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP构建出过表达CRABP2的pCDH-CRABP2，选用293T细胞进行病毒包装，将病毒载体感染HCCLM3细胞，通过测序和western blot检测，建立起稳定的CRABP2基因过表达HCCLM3细胞株。7.利用CRABP2shRNA稳定干扰的HCCLM3细胞株，建立裸鼠皮下移植瘤，研究了CRABP2基因干扰对HCCLM3细胞体内成瘤能力和生长、增殖的影响，western blot检测了瘤块的CRABP2蛋白表达情况。8.采用Western blot方法检测了病毒稳定干扰和稳定过表达CRABP2后HCCLM3细胞株的MAPK信号通路、Cyclins/CDKs、VCAM1、ADH1C、c-Myc、NF-κB的蛋白水平表达变化。稳定干扰实验分为阴性对照组pMKO.1-NC和稳定干扰组CRABP2shRNA；稳定过表达实验分为空载体组pCDH-Vector和稳定过表达组pCDH-CRABP2。9. Real-time PCR进一步验证CRABP2稳定干扰和过表达时蛋白表达水平改变的基因mRNA变化，包括CDK2、Cyclin E1、CDK4、CDK6、Cyclin D1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1及ADH1C。结果:1.通过RNA和蛋白检测，发现CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的表达量均高于非转移肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2和人肝细胞L02。2.组织芯片的免疫组化结果发现，CRABP2在肝癌组织和癌旁组织的细胞浆中均有表达，无明显差异；但CRABP2在肝癌组织细胞核中的染色强度和比率都高于癌旁组织细胞，计算的染色分数差异有显著性。3.特异性siRNA在50nM的浓度下对HCCLM3细胞内CRABP2的表达起到了有效的干扰作用：在作用48h后，其mRNA的转录下调了60%以上，72h后的蛋白表达量也明显降低。4. CCK-8实验结果：与对照组比较，在50nM的特异性siRNA干扰后HCCLM3细胞的增殖被抑制。流式细胞术检测细胞周期结果显示，在siRNA干扰CRABP2表达72h后，HCCLM3细胞G0/G1期的比例没有明显变化，S期的细胞减少明显，G2/M期的细胞增多明显。细胞凋亡的结果显示：干扰组与对照组细胞的凋亡率变化不明显。siRNA干扰后HCCLM3细胞的迁移侵袭能力受到抑制。5.应用pMKO.1载体成功构建了pMKO.1-CRABP2shRNA逆转录病毒载体，病毒包装后经稳转HCCLM3细胞株有效干扰了CRABP2基因的表达。6.应用pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP (pCDH)载体成功构建pCDH-CRABP2慢病毒载体，病毒包装后经稳转HCCLM3细胞株使CRABP2基因有效高表达。7.裸鼠成瘤实验结果显示，CRABP2-shRNA组细胞在裸鼠体内肿瘤生长速度减慢，成瘤能力下降，移植瘤体积和重量均低于对照组。8. Western blot结果表明：稳定干扰CRABP2组的CDK2、Cyclin A、Cyclin E1、CDK4、CDK6、Cyclin D1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1和ADH1C的蛋白表达水平明显低于阴性对照组（P＜0.05）；p38MAPK、MEK1/2、ERK1/2、c-Myc和NF-κB分子的蛋白表达水平无明显改变（P＞0.05）。进一步用稳定过表达CRABP2的HCCLM3细胞来反向验证，证实稳定过表达CRABP2后细胞的上述蛋白表达变化刚好与稳定干扰的细胞蛋白表达变化相反。CRABP2稳定过表达组细胞CDK2、Cyclin A、Cyclin E1、CDK4、CDK6、Cyclin D1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1和ADH1C的表达水平明显高于空载体组（P＜0.05）。9.在稳定干扰CRABP2时，Real-time PCR结果显示：稳定干扰组的CDK2、Cyclin E1、CDK4、CDK6、Cyclin D1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1及ADH1C的mRNA表达水平低于阴性对照组。在稳定过表达CRABP2时，Real-time PCR结果显示：稳定过表达组的CDK2、CyclinE1、CDK4、CDK6、Cyclin D1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1及ADH1C的mRNA表达水平高于空载体组。Real-time PCR检测的上述基因mRNA变化与Western blot检测的蛋白变化趋势是一致的。结论:本研究显示CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的表达高于非转移肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2和人肝细胞L02。CRABP2在肝癌组织细胞核中的表达高于癌旁组织细胞。干扰CRABP2表达能抑制HCCLM3细胞的体外增殖，引起细胞周期阻滞，对细胞凋亡无影响，降低迁移和侵袭能力。我们成功构建并感染了稳定干扰或稳定过表达CRABP2基因的HCCLM3细胞株，稳转细胞株用于后续实验。CRABP2促进了肝癌细胞HCCLM3的裸鼠体内成瘤。CRABP2主要通过MKK4/JNK/c-Jun信号传导轴而调控HCCLM3细胞的生物学行为；同时影响了VCAM1和ADH1C的表达而促进HCCLM3细胞的迁移侵袭和肿瘤进展；通过影响部分Cyclins/CDKs的表达，异常调节了细胞周期，进而使细胞过度增殖。