【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种猪的急性、热性、高度接触性传染病,又称非洲猪瘟疫或疣猪病,临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为特征。该病属于世界动物卫生组织（OIE）要求法定报告的动物疫病,我国动物病原微生物名录中将其列为一类动物疫病。自2018年8月我国首次报道
【基金项目】
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国家重点研发计划畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发专项课题“潜在入侵的畜禽疫病口岸监测技术研究”（2016YFD0501104）；
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种猪的急性、热性、高度接触性传染病,又称非洲猪瘟疫或疣猪病,临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为特征。该病属于世界动物卫生组织（OIE）要求法定报告的动物疫病,我国动物病原微生物名录中将其列为一类动物疫病。自2018年8月我国首次报道非洲猪瘟病例以来,目前疫情已蔓延至我国31个省份和地区,给我国生猪养殖业带来巨大经济损失,也为我国防控非洲猪瘟工作带来极大挑战。由于目前尚没有针对非洲猪瘟的特效药物,扑杀根除需花费漫长时间并付出巨大代价,相比之下疫苗是防控非洲猪瘟疫情最经济、有效的方法。但传统灭活疫苗、亚单位疫苗等对猪群的保护能力差或无保护,因此通过基因缺失致弱的减毒活疫苗成为当前非洲猪瘟疫苗研究的主要方向。本课题的主要目的是研究CRISPR/Cas9和Cre/loxp基因编辑系统是否能高效构建非洲猪瘟基因缺失毒株并对重组毒株的性能进行初步研究,以期为非洲猪瘟基因缺失疫苗的制备提供参考。本研究利用CRISPR/Cas9和Cre/loxp基因编辑系统构建非洲猪瘟双基因缺失活疫苗候选毒株。首先,对ASFV的几种转染方法进行筛选,确定ASFV的最适转染方法。然后,通过CRISPR/Cas9系统构建非洲猪瘟CD2v单基因缺失毒株（CHINA2018/1/△CD2v/e GFP）,对获得的毒株进行纯化、传代及鉴定。在CHINA2018/1/△CD2v/e GFP的基础上,利用CRISPR/Cas9系统构建非洲猪瘟CD2v/UK双基因缺失毒株（CHINA 2018/1/△CD2v/△UK）,对纯化后的CHINA 2018/1/△CD2v/△UK进行病毒滴定、增殖性能测试、外源因子检测以及稳定性研究。同时,为减少外源基因对重组毒的影响,利用Cre/loxp系统将CHINA 2018/1/△CD2v/e GFP中的e GFP基因敲除,通过PCR和测序对重组毒（CHINA 2018/1/△CD2v）进行鉴定。结果显示:脂质体转染为ASFV最适的转染方法,相较于电转和体外sg RNA+Cas9蛋白转染,经脂质体转染获得的毒株可以稳定的进行传代。此外,本试验成功构建了非洲猪瘟CD2v单基因缺失毒株（CHINA 2018/1/△CD2v/e GFP）,并在此基础上构建了CD2v/UK双基因缺失毒株（CHINA 2018/1/△CD2v/△UK）;同时,利用Cre/loxp系统敲除了CHINA 2018/1/△CD2v/e GFP中的荧光基因e GFP,获得了基因缺失毒株（CHINA2018/1/△CD2v）。对CHIN A 2018/1/△CD2v/△UK进行病毒滴度检测,其病毒滴度为10~7TCID50/m L,与亲本毒株（CHIN A 2018/1）相比,重组毒株的复制能力高于亲本毒株。本研究利用CRISPR/Cas9和Cre/loxp基因编辑技术构建了非洲猪瘟双基因缺失毒株,得到的重组毒株不仅有较高的重组效率,而且相较于亲本毒株有更好的复制能力,这对当前非洲猪瘟基因缺失疫苗的研发至关重要。
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