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猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起猪的一种急性高度接触性肠道传染性疾病。临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水并最终导致仔猪死亡。该病对哺乳期仔猪具有极高的感染率,感染后致死率高达95%以上,给养猪业带来极大地危害。从2010年起,PEDV疫苗的免疫效果越来越差,免疫后的猪群同样爆发PEDV且出生仔猪死亡率高达90%以上。在如此大环境下急需探寻新方法来防治PED。益生菌能通过调节宿主肠道黏膜免疫系统维持肠道内环境微生物稳态,提高营养物质吸收效率,维持肠道菌群平衡,起到保护肠道健康的功能。已有研究表明,多种益生菌代谢产物具有抗病毒作用且能调节大鼠小肠上皮细胞中的钙离子浓度,本实验室前期成功分离得到一株植物乳杆菌,命名为LP-1,前期试验表明该菌株上清液能够抑制PEDV感染,但具体机制还未知。Ca2+作为细胞内信号转导过程中重要的第二信使,是维持和调节机体生理功能的必需元素。当Ca2+稳态遭到破坏时,将会引发疾病和代谢紊乱。有研究表明一些病毒感染之后,能调控细胞内钙离子水平或钙离子通道以达到促进自身感染和复制的目的。目前尚不明确PEDV感染过程中能否引起钙离子浓度上升促进自身复制。基于此,探究Ca2+在PEDV感染过程中作用,植物乳杆菌LP-1上清是否通过调控Ca2+抗病毒,这两点为PEDV的防治的新方法提供理论基础。本论文的内容及结果如下:植物乳杆菌LP-1上清抗PEDV-LJX株作用研究:测定植物乳杆菌LP-1生长曲线,确定12h为上清的最佳获取时间。MTT法检测LP-1S1/4倍稀释为IPEC-J2细胞的最大无毒剂量,Western-blot检测发现1/4倍稀释为抗PEDV最佳浓度且具有浓度依赖性。LP-1S处理IPEC-J2细胞在8h、12h、24h时能显著降低PEDV N蛋白表达,TCID50结果表明在12h、24h、48h时LP-1S预处理组能显著降低病毒滴度。表明植物乳杆菌LP-1上清具有良好的抗PEDV作用。细胞外Ca2+浓度变化对PEDV复制研究:用火焰原子吸收法建立Ca2+浓度标准曲线,用火焰原子吸收法检测细胞外Ca2+浓度,PEDV感染后细胞外Ca2+浓度低于空白对照组。用钙离子荧光探针Fluo-3AM检测细胞内Ca2+浓度,PEDV感染组细胞内Ca2+荧光强度都极显著高于空白对照组的Ca2+荧光强度。MTT法检测EGTA细胞毒性,用EGTA螯合细胞外Ca2+,绝对荧光定量PCR方法检测IPEC-J2细胞中PEDV M基因拷贝数,Western-blot方法检测PEDV N蛋白表达量,EGTA预处理组PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量都显著低于PEDV组。为了确定EGTA对PEDV增殖的影响,在用EGTA处理细胞后加入Ca Cl2补充细胞外钙离子,绝对荧光定量PCR、Western-blot检测发现添加Ca Cl2后能回复PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。用钙离子通道抑制剂盐酸苄普地尔处理细胞,发现盐酸苄普地尔预处理组能降低PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。利用钙螯合剂BAPTA-AM预处理IPEC-J2细胞,发现BAPTA-AM预处理也能降低PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。这些结论说明细胞内外Ca2+在PEDV感染过程中起着重要作用。植物乳杆菌LP-1上清调控钙离子抗PEDV作用研究:用火焰原子吸收法检测细胞外Ca2+浓度,在2h、8h、24h、48h时LP-1S能恢复由于PEDV感染引起的细胞外Ca2+浓度降低。用钙离子荧光探针Fluo-3AM检测细胞内Ca2+浓度,LP-1S处理组能降低由于PEDV感染引起的钙离子浓度异常升高。用相对荧光定量检测TRPV6的表达量,PEDV组能升高TRPV6的表达量,LP-1S预处理组能降低在PEDV感染情况下TRPV6的表达。用Western-blot检测TRPV6的表达量在6h和24h时LP-1S能够降低在PEDV感染情况下TRPV6的蛋白表达。用相对荧光定量检测PMCA1b的表达量,LP-1S能够升高在PEDV感染情况下PMCA1b的表达。用Western-blot检测PMCA1b的表达量在6h和12h两个时间点LP-1S能够升高在PEDV感染情况下PMCA1b的蛋白表达。结果表明植物乳杆菌LP-1上清能调控TRPV6和PMCA1b来减少进入细胞内Ca2+量达到抗PEDV的作用。干扰TRPV6和PMCA1b影响PEDV复制初步研究:转染质粒在24h达到稳定转染的状态,使用Western-blot检测干扰效率为40%左右。使用钙离子探针Fura-2AM检测干扰TRPV6和PMCA1b后细胞内Ca2+浓度,在干扰PMCA1b后会降低细胞膜对钙离子的通透性,减少钙离子向细胞外排出,一定程度增加细胞内钙离子浓度,干扰TRPV6后胞内钙离子稍有上升。使用绝对荧光定量PCR、Western-blot、TCID50检测干扰TRPV6组的PEDV N蛋白、PEDV M基因、病毒滴度都显著高于PEDV组,干扰TRPV6后导致PEDV显著升高与预期不符其原因可能是代偿机制引起其他钙离子信号通路表达变化。TRPV6在PEDV感染过程中的具体代偿机制还需要进一步探究。干扰PMCA1b后PEDV N蛋白、PEDV M基因、病毒滴度显著高于PEDV组,说明干扰PMCA1b后细胞内Ca2+浓度上升是导致PEDV复制增多的主要原因。综上所述:细胞内外Ca2+在PEDV感染过程中起着重要作用,植物乳杆菌LP-1上清能通过调节TRPV6和PMCA1b的表达量来调控细胞内Ca2+浓度来达到抗PEDV的作用。TRPV6和PMCA1b在PEDV感染中起着重要作用。