牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosai disease virus，BVDV)是黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)代表种(RIB Franch 1991)，BVDV主要引起牛的病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)，表现为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产、死胎和畸胎等。在欧美等国，BVDV引发的临床症状影响或潜在影响到养牛业生产的每个环节，如产奶量下降、生长迟缓、繁殖能力下降和继发感染等，近年来通过严格的检测，及时清除持续性感染牛等综合措施，BVDV得到了有效控制。该病在我国二十几个省份存在，但由于没有量化BVDV对养牛业危害的评价系统及合适的检测方法，该病一直被忽视。本研究通过RT-PCR技术和5′末端快速扩增法(5′RACE)成功地扩增了引自中监所的BVDV Oregon C24V株全基因序列，并进行了克隆、序列的测定与分析。测序结果拼接成完整的基因组全序列，基因组结构为：基因组全长12305个碱基，5′非编码区381个碱基，3′非编码区182个碱基，5′和3′非编码区之间有一个大的开放阅读框(ORF)，有11742个碱基，起始密码子和终子密码子分别为ATG和TAA，编码3914氨基酸的聚合蛋白。核苷酸同源性比较分析表明本毒株与VEDEVAC株同源性最高为99.50％，其次为Osloss株为92.00％，与Oregon C24V仅为79.41％，推导出氨基酸同源性比较同VEDEVAC株为99.11％，Osloss株为92.93％，Oregon C24V为87.22％。核苷酸和氨基酸进化树分析表明本毒株与VEDEVAC株亲缘关系最为密切。从以上事实推测本毒株并非是Oregon C24V标准株。利用序列本身单一酶切位点将相互重叠、覆盖全基因组的9个片段分别构建成5′和3′两个半长片段，5′端引入T7启动子核心序列；在2920位置通过PCR技术，沉默突变引入AsuⅡ位点作为感染性克隆的遗传标记；为了使转录反应能正确终止，在3′端引入单一酶切位点SacⅡ，通过长片段融合PCR技术将两个半长融合到一起构成完整的全基因组片段，最后连接到低拷贝载体pOK-12上，完成BVDV感染性cDNA载体的构建。PCR扩增BVDV的P14、E2和NS3基因，分别亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上，构建了含3种基因的重组真核表达载体。将以上构建的3种真核表达载体转染牛鼻甲细胞进行瞬时表达，结果在转染48h后P14、E2和NS3得了表达，间接免疫荧光为阳性，而空质粒pcDNA3.1(+)和未转染质粒组的牛鼻甲细胞均呈阴性反应。体外转染实验表明含P14、E2和NS3真核表达载体均能在体外获得表达，从而为下一步的动物试验提供了前提条件。为了评价所构建3种DNA疫苗的免疫效果，将6-8周龄的雌性昆明鼠随机分成4组，分别将它们以每只鼠100μg的剂量分两点肌肉注射接种，同时以空质粒pcDNA3.1(+)做对照。每两周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前采血ELISA法检测抗BVDV抗体，同时检测外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的动态变化。结果显示：(1)pcDNA3.1(+)-P14、pcDNA3.1(+)-E2、pcDNA3.1(+)-NS3免疫组抗体为阳性。(2)IFN-γ检测pcDNA3.1(+)-P14、pcDNA3.1(+)-E2、pcDNA3.1(+)-NS3组均高于pcDNA3.1(+)空质粒组。(3)pcDNA3.1(+)-P14、pcDNA3.1(+)-E2、pcDNA3.1(+)-NS3免疫组免疫后外周血CD4~+ T淋巴细胞均有升高，CD8~+T淋巴细胞pcDNA3.1(+)-E2组呈上升趋势。通过本研究证实，所构建的DNA疫苗能够诱导小鼠产生一定程度的体液免疫和细胞免疫应答。本研究成功对中监所BVDV Oregon C24V株进行了全基因克隆；利用基因重组和长片段融合PCR技术构建了感染性克隆载体；分别构建了含有结构蛋白P14、E2和非结构蛋白NS33种基因的DNA疫苗，并进行了体外瞬时表达和动物体内接种试验。总之，通过本研究将为牛BVDV新型疫苗的研制提供了科学的实验依据，并奠定良好技术基础和物质储备。