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目的:针刺对心肌缺血具有较满意的疗效,是理想的治疗手段之一,但针刺治疗作用机理尚未完全明确。本研究旨在通过探讨电针内关穴对心肌缺血大鼠的治疗作用,通过观察电针前后心肌细胞形态结构、比较电针前后血栓素B2(TXB2)、前列腺素1α(PGF1α)、缺氧诱导因子(HIF-1α)、一氧化氮(NO)等细胞因子含量的影响以及调节作用,并突破心肌缺血过程中对传统钠、钾、钙等离子通道的研究,从酸敏感离子通道角度来揭示电针治疗心肌缺血作用的机制。材料与方法:论文一:选用健康SPF级雄性SD大鼠50只,体重230±50g,由辽宁长生生物技术有限公司提供,采用随机对照方法分为正常组(A)、模型组(B)、内关组(C)、列缺组(D)、非经非穴组(E),每组10只。各组大鼠给药前称重,四肢皮下多点注射异丙肾上腺素。剂量:85mg/kg,日一次,连续两次成模。造模成功后,对内关组(C)、列缺组(D)、非经非穴组(E)大鼠分别进行针刺,再连接电针仪,进行电针治疗。电针治疗1周后,各组SD大鼠称重,腹腔注射3.5%戊巴比妥钠麻醉,麻醉后活体快速分离大鼠左心室心肌组织,然后置于4%的多聚甲醛中,HE染色后光镜下观察心肌细胞形态学变化,通过TUNEL法观察心肌细胞凋亡荧光表达。分离大鼠左心室心肌组织后,各组大鼠腹主动脉抽血,置于加入抗凝剂的EP管中,经离心机离心后后取血清,通过ELISA双抗体夹心法检测TXB2、PGF1α浓度。论文二:选用健康SPF级雄性SD大鼠50只,体重230±50g,由辽宁长生生物技术有限公司提供,采用随机对照方法分为正常组(A)、模型组(B)、内关组(C)、列缺组(D)、非经非穴组(E),每组10只。各组大鼠给药前称重,四肢皮下多点注射异丙肾上腺素。剂量:85mg/kg,日一次,连续两次成模。造模成功后,对内关组(C)、列缺组(D)、非经非穴组(E)大鼠分别进行针刺,再连接电针仪,进行电针治疗。电针治疗1周后,各组SD大鼠称重,腹腔注射3.5%戊巴比妥钠麻醉,麻醉后各组大鼠腹主动脉抽血,置于加入抗凝剂的EP管中,经离心机离心后后取血清,离心后通过固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组HIF-1α含量,应用ELISA法酶标仪测定吸光度,检测各组NO浓度。论文三:选用健康SPF级雄性SD大鼠50只,体重230±50g,由辽宁长生生物技术有限公司提供,采用随机对照方法分为正常组(A)、模型组(B)、内关组(C)、列缺组(D)、非经非穴组(E),每组10只。各组大鼠给药前称重,四肢皮下多点注射异丙肾上腺素。剂量:85mg/kg,日一次,连续两次成模。造模成功后,对内关组(C)、列缺组(D)、非经非穴组(E)大鼠分别进行针刺,再连接电针仪,进行电针治疗。电针治疗1周后,各组SD大鼠称重,腹腔注射3.5%戊巴比妥钠麻醉,活体分离大鼠左心室心肌,置于EP管中,放入-70℃冰箱,Western blot法检测各组ASIC2、ASIC3蛋白表达,Realtime RT-PCR法检测各组ASIC2、ASIC3的基因表达,并应用2^(-△Ctof)得出各组大鼠ASIC2、ASIC3的基因表达多少。分离心肌后腹主动脉快速抽血,置于加入抗凝剂的EP管中,经离心机离心后取血清,通过ELISA法检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量。所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,组间比较采用方差分析(ANOVA),多重比较用最小显著性差异法(least significant difference,LSD)法,P<0.05或P<0.01认为差异具有统计学意义。结果:论文一:1.通过电镜观察电针前后各组心肌细胞形态的变化,心肌细胞经HE染色后,在显微光镜下(400倍)发现,异丙肾上腺素(ISO)模型的心肌缺血大鼠组心肌组织呈不同程度坏死,为多发性灶状和片状坏死,坏死中心部心肌细胞崩解消失,并有大量炎性细胞浸润,同时可见心肌细胞呈不同程度的空泡变性及颗粒变性,间质水肿明显,严重者可见小灶状坏死,心肌坏死灶内可见淋巴细胞浸润。电针内关穴组观察到心肌细胞空泡变性减少,炎性侵润较少,心肌细胞排列规整。列缺组、非经非穴组无显著差异。心肌组织石蜡切片后,每张切片随机选择5个高倍镜视野(×400),每组共30个视野记录阳性细胞数及心肌细胞总数,以凋亡指数(AI)反应各组心肌细胞凋亡的情况,电针1周后,各组大鼠心肌细胞凋亡指数(AI)降低,与模型组比较有显著差异(P<0.05),电针内关组心肌细胞凋亡指数(AI)降低更明显(P<0.01)。经LSD法比较后发现,各电针组间非经非穴组与内关组比较,有显著性差异(P<0.05)。2.采用原位TUNEL法,荧光素标记后在荧光显微镜下(200倍)可观察到异丙肾上腺素(ISO)模型组的心肌缺血大鼠组心肌组织,主要是细胞核棕黄色着染的凋亡阳性细胞较正常组增多,电针内关穴组观察到心肌细胞,主要是细胞核棕黄色着染的凋亡阳性细胞减少。列缺组、非经非穴组无显著差异。3.与正常对照组比较,模型组大鼠血清中TXB2升高,PGF1α含量降低(P<0.05)。电针1周后,各组大鼠血清中TXB2降低,PGF1α含量升高,与模型组比较有显著差异(P<0.05),电针内关组TXB2、PGF1α含量变化更明显(P<0.01)。经LSD法比较后发现,各电针组间的TXB2、PGF1α含量有显著性差异(P<0.05)。论文二:1.与正常对照组比较,模型组大鼠血清中缺氧诱导因子(HIF-1α)浓度值升高(P<0.05)。电针1周后,各组大鼠血清中缺氧诱导因子(HIF-1α)浓度值降低,与模型组比较有显著差异(P<0.05),电针内关组缺氧诱导因子(HIF-1α)浓度值变化更明显(P<0.01)。各电针组间非经非穴组与内关组比较,有显著性差异(P<0.05)。2.与正常对照组比较,模型组大鼠血清中一氧化氮(NO)浓度值升高(P<0.05)。电针1周后,各组大鼠血清中一氧化氮(NO)浓度值降低,与模型组比较有显著差异(P<0.05),电针内关组一氧化氮(NO)浓度值变化更明显(P<0.01)。各电针组间非经非穴组与内关组比较,有显著性差异(P<0.05)。论文三:1.与正常对照组比较,模型组大鼠血清中血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量升高(P<0.01)。电针1周后,各组大鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量降低,与模型组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01),内关组与其他电针组比较,各组大鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量降低,有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。2.与正常对照组比较,模型组大鼠酸敏感离子通道(ASIC2、ASIC3)蛋白表达量明显增高(P<0.01)。电针1周后,各组大鼠心肌细胞中酸敏感离子通道(ASIC2、ASIC3)蛋白表达量降低,与模型组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01),内关组与其他电针组比较,酸敏感离子通道(ASIC2、ASIC3)蛋白表达量降低,有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。3.与正常对照组比较,模型组大鼠酸敏感离子通道(ASIC2、ASIC3)基因表达量明显增高(P<0.01)。电针1周后,各组大鼠心肌细胞中酸敏感离子通道(ASIC2、ASIC3)基因表达量降低,与模型组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01),内关组与其他电针组比较,酸敏感离子通道(ASIC2、ASIC3)基因表达量降低,有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结论:1.电针“内关”穴可有效改善心肌缺血大鼠心肌细胞的损伤和凋亡,降低血清中TXB2,升高PGF1α含量,抑制酸敏感离子通道开放。2.电针“内关”穴可有效降低心肌缺血大鼠血清中缺氧诱导因子(HIF-1α)、一氧化氮(NO)的含量,抑制酸敏感离子通道开放。3.电针“内关”穴可降低心肌缺血大鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量。4.电针“内关”穴可降低心肌缺血大鼠ASIC2、ASIC3蛋白及基因表达量,从而抑制酸敏感离子通道开放,有效改善心肌缺血大鼠心肌细胞的损伤。