研究背景急性高原病(acute mountain disease, AMD)是人体急性暴露于低氧环境后产生的各种病理性反应,是高海拔地区独有的常见病。有报道称,在快速登上4000米海拔高度的人群中,急性高原病的发病率可达到65%。急性高原病主要包括急性高原反应(acute mountain sickness, AMS)、急性高原脑水肿(high altitude cerebral edema, HACE)和急性高原肺水肿(high altitude pulmonary edema, HAPE)。后两种疾病的发病是建立在急性高原反应未得到有效治疗,从而发展为特征明显、症状严重的威胁生命的疾病。HAPE严重威胁登上高海拔的人群健康。急性缺氧时,机体内神经和体液因素使肺动脉压升高,血液成分经血管内皮细胞和肺泡上皮细胞聚积在肺间质内。肺泡腔内液体的异常聚集,阻碍了肺的换气功能和氧气在肺泡内的弥散作用,机体可在数小时内发生进行性的呼吸困难进而造成死亡。已有的调查资料显示,HAPE的综合发病率为7%～17%,寒冷、低温以及过度的体力劳动都是HAPE发病的诱发因素。然而,虽经过数十年的努力,HAPE的治疗仍停留在对症治疗的状态,人们尚不能从根本上治愈HAPE,因此HAPE的预防研究受到了广泛的重视。目前,药物预防是国内外普遍采取的预防HAPE的方法。用于预防HAPE的药物包括西药和中药两大类,常用的西药如硝苯地平、沙美特罗和地塞米松等可以通过拮抗钙离子通道或激动β2受体等途径扩张血管,改善肺组织微循环,从而在一定程度上预防高原环境下HAPE的发病。但由于这些药物对心血管、神经和内分泌系统的副作用而导致其实际使用受到很大限制；常用的中药如银杏内酯、人参皂苷和红景天等虽然可以提高机体对抗缺氧的耐受能力降低HAPE的发病率,但它们多属于贵重中药,资源匮乏并且价格相对昂贵,作为预防HAPE的普及用药难度很大。因此开发一种预防效果好、来源广泛且副作用低的预防HAPE的药物十分必要。马齿苋(Portulaca Orleracea L, PO),为马齿苋科植物全草,在全世界范围内广泛分布,是我国卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一。课题组前期研究表明,马齿苋提取物(Ethanol extract from Portulaca Oleracea, EEPO)可以延长小鼠在密闭环境中的存活时间,并且在缺氧条件下对神经组织具有较强的保护作用。近年来药理研究表明,马齿苋具有抗炎、抗氧化并对血管内皮细胞具有保护作用。以上研究提示,EEPO可能具有预防HAPE的作用。因此,本课题对EEPO预防HAPE的作用进行了观察,并在此基础上对其可能的作用机制进行了探讨。研究目的通过动物实验观察EEPO对HAPE的预防作用,并在此基础上探讨EEPO抗HAPE的作用机制,为将药食两用植物马齿苋开发成预防HAPE保健食品或药物提供一定实验依据。研究方法一、低压低氧致HAPE小鼠模型的制作1、实验动物分组及处理雄性Bal b/c小鼠70只(购自上海西普尔-必凯公司),体重19-24g,适应性喂养5天,按体重随机分为一组对照组和六组模型组,每组10只。将模型组小鼠分别置于低氧舱中模拟海拔高度5000m(大气压53.8kPa)、6000m(大气压47.2kPa)和7000m(大气压41.2kPa)的气压环境处理3h和6h。模拟暴露结束后用10%水合氯醛(0.3ml/100gBW)麻醉。取5只实验动物用PBS溶液经肺动脉冲洗后,离体肺组织,经气管插入导管,灌入生理盐水制作支气管肺泡灌洗液。另取5只实验动物,以0.9%NaCl溶液经肺动脉灌流后取全肺。取右侧肺组织固定于10%中性甲醛溶液,用于制备切片进行组织病理学检查。左侧肺组织,用滤纸吸干表面水分并立即称取湿重,在80℃烘箱内烘烤72h后称取干重。若实验动物在实验过程中死亡,则本实验组将重新进行模拟高原缺氧暴露,死亡的实验动物计入死亡率。2、死亡率的计算死亡率=死亡小鼠(只)/接受模拟高原缺氧暴露小鼠(只)*100%3、小鼠肺组织干湿重测定小鼠肺干湿重比=肺湿重(g)/肺干重(g)*100%4、小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白浓度的测定用BCA法测定支气管肺泡灌洗液中蛋白浓度。选择商业化的BCA试剂盒并按照说明书所提供的方法进行操作。5、小鼠肺组织病理检查肺组织HE染色：动物肺经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后切片、烤片、苏木素-伊红染色,光镜下观察肺组织病理学改变。二、EEPO预防小鼠HAPE的药效观察1、EEPO及阳性对照药人参皂苷的制备EEPO由第二军医大学附属长海医院中医科提供,溶于0.9%生理盐水中,配成低、中、高剂量的溶液,折合成生药量分别为2g/ml、4g/ml、8g/ml。人参皂苷,由第二军医大学附属长海医院中医科提供,溶于0.9%生理盐水中,折合成生药量为8g/ml的溶液。2、实验动物分组及处理雄性Bal b/c小鼠(购自上海西普尔-必凯公司)90只,体重(19～24)g。适应性喂养5天,按体重随机分为空白对照组、HAPE模型组、阳性对照药人参皂苷组(8g/ml)、EEPO低(2g/ml)、中(4g/ml)、高(8g/ml)剂量给药组,每组15只。所有实验动物于每天上午九点按EEPO溶液2.5ml/100g动物体重,对低、中和高剂量三个剂量组灌胃对应浓度EEPO溶液。阳性对照药组按照人参皂苷2.5ml/100g动物体重灌胃,HAPE模型组和空白对照组按照2.5ml/100g动物体重灌胃生理盐水。口服给药前称动物体重以调整灌胃体积,连续灌胃7天。标本采集同第一部分。余下肺组织分装放入冻存管,置-80℃低温冰箱保存。另外,在模拟高原缺氧暴露结束前半小时,取5只实验动物向其体内注射2%的依文思蓝溶液,暴露结束后测定肺组织内依文思蓝含量。3、小鼠肺组织干湿重测定方法同第一部分。4、小鼠BALF蛋白含量测定方法同第一部分。5、小鼠肺组织毛细血管通透性测定结果表示为吸光度(OD)／肺于重(g)6、小鼠肺组织病理检查肺组织HE染色方法同第一部分。三、EEPO预防HAPE作用的机制探讨1、实验动物分组及处理实验动物分组及处理同第二部分。2、小鼠肺组织中氧化应激水平的测定。氧化应激测定试剂盒购自试剂公司(碧云天,中国)。实验中分别对肺组织中的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione, GSH)和超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase, SOD)进行检测,明确氧化产物和抗氧化物在肺组织中的含量。操作严格按照说明书所提供的步骤进行。3、小鼠肺组织中NF-kB通路(IKK, p65)蛋白含量测定选用商品化的细胞核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(南京凯基,中国)从小鼠肺组织匀浆中分离胞浆蛋白与核蛋白。然后用Western Blot法测定胞浆中IKB激酶(IKB kinase, IKK)和细胞核中p65蛋白的表达量。4、小鼠肺组织中IL-1β、TNF-α、P-selectin、E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达量测定采用实时定量荧光PCR法(Real-time PCR)测定小鼠肺组织内白细胞介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、P-选择素(P-selectin)、E-选择素(E-selectin)、内皮细胞粘附分子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) mRNA的表达水平。5、小鼠肺组织IL-1p和TNF-α浓度的测定选用商业化的ELISA试剂盒(欣博盛,中国)对肺组织匀浆中IL-1p和TNF-α浓度进行测定。6、小鼠肺组织选择素(P-selectin, E-selectin)和粘附分子(ICAM-1, VCAM-1)蛋白含量的测定采用Western Blot法测定小鼠肺组织P-选择素、E-选择素、ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达水平。四、数据的统计与处理实验数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计分析。多组间采用单因素方差分析,各组间两两比较采用LSD检验和SNK-q检验；病理检查采用等级资料的秩和检验。实验数据以平均数±标准差(mean±SD)表示,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果一、小鼠急性高原缺氧条件摸索1、小鼠实验过程中的死亡率暴露条件为5000米3小时,6000米3小时组均无实验动物死亡；7000米3小时组有10%实验动物死于舱内：5000米6小时组、6000米6小时组和7000米6小时组的死亡率分别是15%、35.5%和46.7%。2、肺组织干湿重模型组5000米3小时组与6000米3小时组与空白对照组小鼠干湿重相比具有统计学差异(p＜0.05);7000m3h、5000m6h、6000m6h和7000m6h组肺组织干湿重与对照小鼠相比有显著差异(p<0.01)。3、小鼠支气管肺泡灌洗液中蛋白浓度模型组5000米3小时组与空白对照组小鼠支气管肺泡灌洗液中蛋白浓度相比无统计学意义(p=0.80)；6000米3小时组与对照组小鼠相比具有统计学差异(p<0.05)；7000米3小时、5000米6小时、6000米6小时和7000米6小时组支气管肺泡灌洗液中蛋白浓度与对照小鼠相比有不同程度的升高(p<0.01)。4、小鼠肺组织病理检查光学显微镜下观察肺组织病理改变并进行病理学评分。结果显示,5000米、6000米和7000米缺氧暴露6小时后可见较为明显肺损伤。表现为肺泡内有较为明显的水肿、中性粒细胞浸润和肺出血。二、EEPO预防小鼠高原肺水肿的药效观察1、肺干湿重实验结果表明,HAPE模型组小鼠肺组织干湿重与空白对照组相比明显升高(p<0.05),低剂量EEPO组与模型组相比没有统计学差异,中、高剂量EEPO组均不同程度地减轻低压低氧暴露所导致的肺干湿重上升(p<0.05)。阳性对照组小鼠肺组织干湿重较HAPE模型组也有一定程度的降低(p<0.05)。2、BALF中蛋白质浓度HAPE模型组小鼠肺泡灌洗液中总蛋白质浓度较对照组浓度明显升高(p<0.05),预防性给予低剂量EEPO后,支气管肺泡灌洗液蛋白质浓度与缺氧模型组无统计学差异；中、高剂量的EEPO,能够明显降低模拟高原缺氧环境下支气管肺泡灌洗液蛋白浓度(p<0.05),并且EEPO各组之间呈一定的剂量-效应趋势。人参皂苷组小鼠支气管肺泡灌洗液中总蛋白质浓度较模型组有显著降低(p<0.05),但与低、中剂量EEPO组无统计学差异。3、肺毛细血管通透性HAPE模型组与对照组相比小鼠肺组织毛细血管通透性显著升高(p<0.05),预防性给予中、高剂量EEPO可不同程度地降低毛细血管通透性(p<0.05)。人参皂苷组小鼠肺毛细血管通透性较模型组相比也有一定程度的降低(p<0.05),但其与低、中剂量EEPO组在保护小鼠肺毛细血管通透性方面未发现有统计学差异(p>0.05)。4、小鼠肺组织病理光镜下发现HAPE模型组小鼠肺组织出现明显病理损伤,在预防性给予EEPO和人参皂苷可以在不同程度上减轻肺水肿,降低炎症反应和气血屏障损伤。主要表现为血管通透性降低和肺内出血的减少。三、EEPO预防小鼠高原肺水肿的作用的机制探讨1、EEPO对HAPE小鼠肺组织氧化应激水平的影响HAPE模型组小鼠MDA相比较空白对照组有明显升高(p<0.01),与此同时具有抗氧化作用的GSH和SOD水平也出现显著的降低(p<0.05)。预防性给予EEPO后可以不同程度地减轻MDA升高幅度,提高GSH和SOD的浓度(p<0.05)。人参皂苷组也呈现出上述变化,在减轻低压低氧暴露所导致MDA浓度升高的同时,提高机体抗氧化物质GSH和SOD的浓度。2、EEPO对HAPE小鼠肺组织NF-kB通路IKK和p65蛋白表达的影响HAPE模型组肺组织细胞质中IKK和细胞核p65表达量与正常对照组相比均明显增加(p<0.05)。给予EEPO可不同程度地下调HAPE小鼠肺组织细胞质中IKK和细胞核p65表达量(p<0.05),且改变呈剂量-效应趋势。3、EEPO对HAPE小鼠肺组织中炎性细胞因子IL-1p和TNF-α mRNA表达的影响HAPE模型组小鼠肺组织中IL-1p和TNF-α mRNA的表达量较正常对照组增加(p<0.01)。给予不同剂量EEPO进行预防性干预可不同程度地下调HAPE小鼠肺组织中IL-1β和TNF-α mRNA的表达(p<0.05)。中剂量EEPO与阳性对照药组相比无统计学差异。4、EEPO对HAPE小鼠肺组织中选择素(P-selectin, E-selectin) mRNA表达的影响与空白对照组相比,HAPE模型组小鼠肺组织中P-selectin和E-selectin的mRNA表达量均明显增加(p<0.01).预防性给予EEPO可明显下调低压低氧暴露小鼠肺组织中P-selectin和E-selectin mRNA表达,并且呈现一定的剂量效应关系。5、EEPO对HAPE小鼠肺组织中粘附分子(ICAM-1、VCAM-1) mRNA表达量的影响ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达量在HAPE模型组中相比空白对照组有明显增加(p<0.01)。给予EEPO干预可不同程度减轻ICAM-1和VCAM-1mRNA表达。阳性药物也可以降低二者mRNA表达,其作用优于低剂量EEPO组。6、EEPO对HAPE小鼠肺组织中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α蛋白表达的影响正常小鼠肺组织中IL-1β和TNF-α浓度较低,在HAPE模型小鼠中可见IL-1β和TNF-α有明显的升高(p<0.05)。不同剂量的EEPO可改善低压低氧环境下肺组织IL-1β和TNF-a的浓度(p<0.05),且IL-1β和TNF-a的浓度随着EEPO浓度的升高而下降。人参皂苷组与HAPE模型组相比,肺匀浆中的IL-1p和TNF-a蛋白也降低(p<0.05)。7、EEPO对HAPE小鼠肺组织中P-selectin, E-selectin, ICAM-1,和VCAM-1蛋白表达的影响正常小鼠肺组织中选择素和粘附分子蛋白表达较低,在HAPE模型小鼠中可见选择素和粘附分子蛋白表达有明显的升高(p<0.05)。不同剂量的EEPO可改善HAPE小鼠肺组织炎症过程中的选择素和粘附分子蛋白表达,且高剂量EEPO较低剂量EEPO更具有抑制选择素和粘附分子蛋白表达的作用。人参皂苷组与HAPE模型组相比,肺组织选择素和粘附分子蛋白表达量也有所降低(p<0.05),其蛋白表达水平与中剂量EEPO所致的选择素和粘附分子表达水平相当。结论1、在模拟不同海拔高度和不同暴露时间对小鼠肺组织的损伤时发现在模拟海拔6000米和7000米缺氧暴露6小时的条件下,小鼠肺损伤的病理变化较为明显。肺水肿和支气管肺泡灌洗液中蛋白浓度也提示了显著的肺损伤。综合考虑造模过程中小鼠死亡率的情况,确定在后续的药效和机制研究中均采用海拔6000米暴露6小时这一条件进行研究；2、EEPO可减轻HAPE小鼠肺组织含水量、支气管肺泡灌洗液中总蛋白的浓度以及肺毛细血管在低压低氧条件下的通透性。这表明EEPO具有较好的预防低压低氧暴露对肺的损伤作用;3、在预防性给予EEPO干预后小鼠肺组织氧化应激水平相比于HAPE模型组来讲有明显的降低,抑制了NF-kB通路的激活。这样就使得由NF-kB通路介导的炎性细胞因子、选择素和粘附分子mRNA转录水平下降,蛋白表达降低。因此,减轻了肺组织中炎症反应,从而保护了内皮细胞和毛细血管壁的完整性,达到预防HAPE发生的目的；4、EEPO虽然能够抑制NF-kB通路的激活,但EEPO对HAPE保护作用的机制仍需要进一步研究。由于EEPO的发病机制十分复杂,目前对其发病机制的了解尚未明确；而EEPO又为混合物,其预防HAPE的作用可能是通过多条通路的不同靶点来实现的,其更为具体的作用机理仍有待深入探讨。