论文部分内容阅读
目的：在乳腺癌临床治疗中,化疗占有重要的地位,但是由于肿瘤多药耐药的产生,影响了化疗的疗效,甚至导致化疗失败。因此,寻找多药耐药逆转剂来提高化疗疗效是目前肿瘤治疗中急需解决的问题。目前,有关肿瘤多药耐药逆转剂的研究很多,已经发现的肿瘤多药耐药逆转剂包括钙离子通道阻滞剂、钙离子拮抗剂、免疫调节剂等类型,但绝大多数逆转剂由于临床使用时毒副作用比较大而难以应用。传统中药药用历史悠久,毒副作用相对较小,成本较低,所以从中药中寻找安全有效的多药耐药逆转剂成为独特优势。中药灵芝和冬凌草是我国应用广泛的中草药,常用于肿瘤的辅助治疗。本实验主要研究灵芝和冬凌草提取物对人乳腺癌MCF-7/ADM细胞多药耐药的逆转作用,并探讨其可能的逆转机制,阐释灵芝和冬凌草作为肿瘤治疗辅助药物的作用机制,为其深入开发提供理论依据。方法：采用MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测人乳腺癌耐药株MCF-7/ADM细胞对不同化疗药物如阿霉素(Adriamycin, ADM)、顺铂(Cisplatin,DDP)和长春新碱(Vincristine,VCR)的交叉耐药性；MTT法检测灵芝和冬凌草不同活性部位对MCF-7/ADM细胞的细胞毒性作用,从而选择对MCF-7/ADM细胞抑制率小于20%的药物浓度作为该药物的非细胞毒性剂量；用维拉帕米(Ver)作为阳性对照,通过MTT法检测非细胞毒性剂量的灵芝和冬凌草不同活性部位及Ver对MCF-7/ADM细胞的逆转作用；罗丹明123(Rhodamine123, Rh123)蓄积实验进一步检测灵芝和冬凌草不同活性部位对P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)功能的影响；流式细胞术检测灵芝和冬凌草不同活性部位对MCF-7/ADM细胞内ADM蓄积的影响；流式细胞术检测灵芝和冬凌草不同活性部位作用MCF-7/ADM细胞P-gp表达变化的影响；RT-PCR法检测灵芝和冬凌草不同活性部位对MCF-7/ADM细胞MDRl基因的影响；HPLC法对灵芝和冬凌草不同活性部位中活性成分的指纹图谱进行分析,确认该活性部位的特征信息。结果：(1)MTT检测结果显示,MCF-7/ADM细胞不仅对ADM产生耐药性,对DDP和VCR也产生交叉耐药性,且耐药倍数分别为19.23、2.14和2.40倍。(2)细胞毒性试验检测结果发现,灵芝乙酸乙酯和正丁醇部位对MCF-7/ADM细胞的细胞毒性很小,而冬凌草乙酸乙酯和氯仿部位对MCF-7/ADM细胞的细胞毒性偏高,因此,我们选择对MCF-7/ADM细胞的抑制率小于20%,即低于40μg/mL的灵芝乙酸乙酯和正丁醇部位及20μg/mL的冬凌草乙酸乙酯和氯仿部位作为非细胞毒性剂量。(3)在非细胞毒性剂量范围内,灵芝乙酸乙酯(8μg/mL、40μg/mL)灵芝正丁醇(8μg/mL、40μg/mL)冬凌草乙酸乙酯(4μg/mL、20μg/mL)和冬凌草氯仿(4μg/mL、20μg/mL)部位对MCF-7/ADM细胞具有多药耐药逆转作用,且逆转倍数1.78、3.56、2.11、3.47、1.87、4.02、2.16、4.60,呈浓度依赖性。(4)ADM和Rh123蓄积实验检测结果显示,灵芝和冬凌草不同活性部位能够增加MCF-7/ADM细胞内ADM和Rh123的蓄积,从而抑制Rh123的外排,但对MCF-7细胞内ADM和Rh123蓄积的影响很小。(5)流式细胞术检测显示,灵芝和冬凌草不同活性部位能够下调MCF-7/ADM细胞内P-gp的表达。(6)RT-PCR法检测结果显示,经灵芝和冬凌草不同活性部位作用前后,MCF-7/ADM细胞内MDR1基因转录水平有下降的趋势,且随着浓度增加下降趋势就越明显。(7)指纹图谱显示,灵芝乙酸乙酯和正丁醇部位的指纹图谱非常相似,共有12个图谱特征峰,其中12号峰是标品麦角甾醇,其相对含量分别为1.70%和1.91%。冬凌草乙酸乙酯和氯仿部位图谱峰也非常相似,共有11个图谱特征峰,其中含量最高的6号峰是冬凌草甲素,其相对含量分别为15.46%和13.84%。结论：灵芝和冬凌草提取物具有较强的逆转人乳腺癌MCF-7/ADM细胞多药耐药的活性。它们的逆转机制可能是通过下调MDR1基因及其P-gp的表达,抑制MCF-7/ADM细胞P-gp的外排功能,增加细胞内ADM的浓度,使P-gp介导的MCF-7/ADM细胞对ADM的敏感性得到恢复,从而达到逆转肿瘤多药耐药的作用。灵芝和冬凌草中具有逆转MDR的有效成分不仅仅是麦角甾醇和冬凌草甲素,还有其他成分。