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怀牛膝(Achyranthes bidentata Blume)是我国重要的大宗药材之一，也是河南省著名“四大怀药”之一。本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为常用的植物遗传转化材料，是重要的模式植物之一。本研究利用电子克隆与反转录PCR(RT-PCR)技术成功克隆并鉴定出怀牛膝环阿屯醇合成酶(CAS)基因cDNA全长序列，并利用生物信息学相关软件对CAS基因氨基酸序列进行了理化性质和空间结构分析。根据同源重组原理，利用无缝克隆(NovoRec?PCR克隆)方法成功构建了植物过表达载体pART-CAM-CAS和pCAM35s-GFP-CAS。其中pART-CAM-CAS载体用于转化烟草植物组培苗，以研究转基因烟草的基因表达和相关代谢产物的成分含量变化；并对pCAM35s-GFP-CAS载体在烟草表皮细胞中的亚细胞定位进行了分析。此外，本实验还研究了外源大豆异黄酮对UV-B辐射下怀牛膝生长发育的影响。主要研究结果如下：
1.首次克隆出怀牛膝CAS基因cDNA全长序列。怀牛膝CAS基因cDNA全长为2822bp，其中包含3’-UTR区259bp，5’-UTR区289bp和一个长度为2274bp的ORF区。
2.生物信息学分析表明，怀牛膝CAS基因ORF区共编码氨基酸残基757个。与短柄草(Beta vulgaris subsp. Vulgaris，XP_010677527.1)、藜麦(Chenopodium quinoa， XP_021725542.1)、菠菜(Spinacia oleracea，XP_021855885.1)的CAS蛋白氨基酸序列相似度最高，亲缘关系最近。怀牛膝CAS蛋白分子量为86.31162kDa，理论等电点为6.19，为不稳定亲水性蛋白。其氨基酸序列中含有28个丝氨酸，11个苏氨酸，13个酪氨酸需要磷酸化。怀牛膝CAS蛋白的转运不需要信号肽的参与，无跨膜结构域，为非分泌蛋白。对怀牛膝CAS蛋白进行二级结构分析发现，α-螺旋(Alpha Helix，h)和无规则卷曲(Random coil，c)是其主要结构，分别占44.78%和34.08%。三级结构分析结果显示，怀牛膝CAS蛋白与人的羊毛甾醇合酶(Lanosterol synthase)蛋白高度一致，覆盖率达93%。
3.将植物过表达载体pART-CAM-CAS转入本氏烟草组培苗细胞，结果发现转基因烟草植株中CAS基因表达水平显著高于对照组。与野生型烟草相比，转基因烟草根中齐墩果酸含量没有显著变化，茎和叶中齐墩果酸含量则显著降低；转基因烟草植株根、茎、叶中的蜕皮甾酮含量与野生型烟草相比均显著升高。说明CAS基因通过调控合成环阿屯醇合成酶，在齐墩果酸和蜕皮甾酮的生物合成途径中发挥了调节作用，CAS基因过表达对齐墩果酸合成起负向调节作用，对蜕皮甾酮的生物合成起正向调节作用。
4.将植物表达载体pCAM35s-GFP-CAS瞬时转化烟草的表皮细胞，进行亚细胞定位分析，发现怀牛膝CAS蛋白主要存在于细胞质中和细胞核核膜上。
5.外源大豆异黄酮对UV-B辐射下怀牛膝抗氧化酶活性、MDA含量、生长指标、光合色素含量、活性氧(ROS)水平、主要药用成分含量及其相关酶编码基因表达水平的影响研究表明，UV-B辐射会影响怀牛膝的生长和发育，导致活性氧的积累和抗氧化系统的破坏。1mg/L的外源大豆异黄酮处理能使UV-B辐射下怀牛膝幼苗MDA和H2O2含量、O·2?产生的速率显著降低，显著提高了怀牛膝幼苗对UV-B辐射胁迫的耐受性，缓解了UV-B辐射对怀牛膝幼苗造成的损伤。此外，1mg/L的大豆异黄酮处理后，能使叶中齐墩果酸和蜕皮甾酮的含量显著降低，根中齐墩果酸的含量显著增加，但对UV-B胁迫下根中的蜕皮甾酮含量没有显著影响。qRT-PCR分析结果表明，大豆异黄酮对怀牛膝中相关抗氧化酶基因及次级代谢途径酶编码基因表达水平的影响程度不同。
通过对实验结果进行分析，本研究主要得到了如下结论：
1.首次成功克隆出怀牛膝CAS基因cDNA全长序列。
2.生物信息学分析发现，怀牛膝与短柄草、藜麦和菠菜的CAS蛋白氨基酸序列相似度最高，亲缘关系最近。CAS蛋白为不稳定亲水性蛋白，转运不需要信号肽的参与，无跨膜结构域，为非分泌蛋白。
3.转入CAS基因过表达载体的转基因烟草植株中，CAS基因表达水平显著高于对照组。
4.过表达CAS基因使转基因烟草茎和叶中的齐墩果酸含量显著降低，而蜕皮甾酮含量在根、茎、叶组织中均显著升高。
5.亚细胞定位分析发现，怀牛膝CAS蛋白主要存在于烟草表皮细胞的细胞质中和细胞核核膜上。
6.1mg/L的外源大豆异黄酮处理能显著提高怀牛膝幼苗对UV-B辐射胁迫的耐受性，有效缓解UV-B辐射对怀牛膝植株造成的损伤。
1.首次克隆出怀牛膝CAS基因cDNA全长序列。怀牛膝CAS基因cDNA全长为2822bp，其中包含3’-UTR区259bp，5’-UTR区289bp和一个长度为2274bp的ORF区。
2.生物信息学分析表明，怀牛膝CAS基因ORF区共编码氨基酸残基757个。与短柄草(Beta vulgaris subsp. Vulgaris，XP_010677527.1)、藜麦(Chenopodium quinoa， XP_021725542.1)、菠菜(Spinacia oleracea，XP_021855885.1)的CAS蛋白氨基酸序列相似度最高，亲缘关系最近。怀牛膝CAS蛋白分子量为86.31162kDa，理论等电点为6.19，为不稳定亲水性蛋白。其氨基酸序列中含有28个丝氨酸，11个苏氨酸，13个酪氨酸需要磷酸化。怀牛膝CAS蛋白的转运不需要信号肽的参与，无跨膜结构域，为非分泌蛋白。对怀牛膝CAS蛋白进行二级结构分析发现，α-螺旋(Alpha Helix，h)和无规则卷曲(Random coil，c)是其主要结构，分别占44.78%和34.08%。三级结构分析结果显示，怀牛膝CAS蛋白与人的羊毛甾醇合酶(Lanosterol synthase)蛋白高度一致，覆盖率达93%。
3.将植物过表达载体pART-CAM-CAS转入本氏烟草组培苗细胞，结果发现转基因烟草植株中CAS基因表达水平显著高于对照组。与野生型烟草相比，转基因烟草根中齐墩果酸含量没有显著变化，茎和叶中齐墩果酸含量则显著降低；转基因烟草植株根、茎、叶中的蜕皮甾酮含量与野生型烟草相比均显著升高。说明CAS基因通过调控合成环阿屯醇合成酶，在齐墩果酸和蜕皮甾酮的生物合成途径中发挥了调节作用，CAS基因过表达对齐墩果酸合成起负向调节作用，对蜕皮甾酮的生物合成起正向调节作用。
4.将植物表达载体pCAM35s-GFP-CAS瞬时转化烟草的表皮细胞，进行亚细胞定位分析，发现怀牛膝CAS蛋白主要存在于细胞质中和细胞核核膜上。
5.外源大豆异黄酮对UV-B辐射下怀牛膝抗氧化酶活性、MDA含量、生长指标、光合色素含量、活性氧(ROS)水平、主要药用成分含量及其相关酶编码基因表达水平的影响研究表明，UV-B辐射会影响怀牛膝的生长和发育，导致活性氧的积累和抗氧化系统的破坏。1mg/L的外源大豆异黄酮处理能使UV-B辐射下怀牛膝幼苗MDA和H2O2含量、O·2?产生的速率显著降低，显著提高了怀牛膝幼苗对UV-B辐射胁迫的耐受性，缓解了UV-B辐射对怀牛膝幼苗造成的损伤。此外，1mg/L的大豆异黄酮处理后，能使叶中齐墩果酸和蜕皮甾酮的含量显著降低，根中齐墩果酸的含量显著增加，但对UV-B胁迫下根中的蜕皮甾酮含量没有显著影响。qRT-PCR分析结果表明，大豆异黄酮对怀牛膝中相关抗氧化酶基因及次级代谢途径酶编码基因表达水平的影响程度不同。
通过对实验结果进行分析，本研究主要得到了如下结论：
1.首次成功克隆出怀牛膝CAS基因cDNA全长序列。
2.生物信息学分析发现，怀牛膝与短柄草、藜麦和菠菜的CAS蛋白氨基酸序列相似度最高，亲缘关系最近。CAS蛋白为不稳定亲水性蛋白，转运不需要信号肽的参与，无跨膜结构域，为非分泌蛋白。
3.转入CAS基因过表达载体的转基因烟草植株中，CAS基因表达水平显著高于对照组。
4.过表达CAS基因使转基因烟草茎和叶中的齐墩果酸含量显著降低，而蜕皮甾酮含量在根、茎、叶组织中均显著升高。
5.亚细胞定位分析发现，怀牛膝CAS蛋白主要存在于烟草表皮细胞的细胞质中和细胞核核膜上。
6.1mg/L的外源大豆异黄酮处理能显著提高怀牛膝幼苗对UV-B辐射胁迫的耐受性，有效缓解UV-B辐射对怀牛膝植株造成的损伤。