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研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),当前全球 METH 滥用形势日益严峻,呈现出区域不断扩大、滥用率急剧增长、年龄结构低龄化等特点因此对METH的毒性及防治的研究已成为世界面临的重大课题。大量研究表明,METH主要作用于中枢神经系统,主要表现为多巴胺等单胺类神经末梢的损伤,METH可导致大脑出现与阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease AD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等神经退行性病变类似的病理学改变。本实验室多年来致力于METH神经毒性相关分子机制方面的研究,前期研究已经发现在体内外实验中αα-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在METH所导致的多巴胺能神经元损伤、氧化应激系统失衡和线粒体功能障碍等机制中发挥重要作用。α-Syn是由140个氨基酸组成的可溶性非折叠蛋白,是PD特征性病理结构——路易氏小体(Lewy’s body)的主要组成部分。目前研究证明,α-Syn的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、硝基化都在α-Syn的聚集和神经毒性中发挥了重要作用,而类泛素化修饰与α-Syn的作用机制尚不明确。类泛素化蛋白(small ubiquitin-like modifier)是泛素蛋白家族成员之一,类泛素化蛋白通过E1活化酶、E2结合酶和E3连接酶的级联反应,以共价键结合到靶蛋白的赖氨酸残基上,从而调节靶蛋白的定位以及靶蛋白与其他大分子的相互作用。据报道称,在神经退行性疾病患者大脑组织中检测出类泛素化蛋白,并且SUMO-1与患者大脑内病理性包涵体共定位,说明类泛素化蛋白在神经退行性疾病中的重要性。α-Syn是类泛素化的重要底物蛋白之一,研究报道α-Syn主要通过赖氨酸96和102位点发生类泛素化,但是,关于α-Syn类泛素化在METH的神经毒性中的作用机制尚未明确。目的:本实验旨在阐明α-Syn类泛素化水平变化与METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集及神经毒性之间的关系,探究METH对α-Syn类泛素化及其关键酶的作用,证实METH不仅诱导α-Syn表达增加,也促使α-Syn蛋白异常聚集,通过调节α-Syn类泛素化水平变化能够影响METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集情况,影响α-Syn通过泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径的降解机制,从而证明调控α-Syn类泛素化能够减轻METH导致的α-Syn高表达、异常聚集及多巴胺能神经元损伤,为METH神经毒性分子靶向治疗提供一定的理论基础和研究方向。方法:1、检测METH处理SH-SY5Y细胞、C57小鼠原代神经元细胞以及C57小鼠METH亚急性中毒模型中SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集情况;2、免疫共沉淀检测METH处理SH-SY5Y细胞、原代神经元细胞以及C57小鼠METH亚急性中毒模型中α-Syn类泛素化水平;3、检测METH诱导SH-SY5Y细胞、原代神经元细胞中E1、E2、E3关键酶表达变化;4、前期研究发现E2酶UBC9在METH诱导的α-Syn类泛素化水平下降中起关键作用,检测在SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞中过表达UBC9对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;5、检测在SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞中沉默SUMO-1对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;6、在SH-SY5Y细胞中转染慢病毒并筛选稳定表达细胞株,检测定点突变α-Syn类泛素化位点K96/102R对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响;7、检测在C57小鼠METH亚急性中毒模型中定点突变α-Syn类泛素化位点K96/102R对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响。结果:1、METH诱导体内外实验中SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集情况:(1)以浓度梯度METH处理SH-SY5Y细胞24h,随着浓度升高SUMO-1、α-Syn表达量呈上升趋势,α-Syn聚集水平也呈上升趋势,当给药浓度达到2.5mmol/L 时达到顶峰,2.5mmol/L METH 处理 SH-SY5Y 细胞 24h,SUMO-1 和α-Syn表达量分别上升了 1.77倍和1.73倍,α-Syn聚集水平上升1.76倍,具有显著差异。以2.0mmol/LMETH按照时间梯度处理SH-SY5Y细胞,随着处理时间延长,SUMO-1、α-Syn表达量和α-Syn聚集水平均呈上升趋势,具有显著差异。(2)以浓度梯度METH处理原代神经元细胞24h随着浓度升高SUMO-1、α-Syn表达量呈上升趋势,当给药浓度达到1.Ommol/L时达到顶峰,1.Ommol/L METH处理原代神经元细胞24h SUMO-1和α-Syn表达量分别上升了 2.23倍和2.71倍,具有显著差异。以1.0mmol/L METH按照时间梯度处理原代神经元细胞,随着处理时间延长,SUMO-1、α-Syn表达量均呈上升趋势,具有显著差异。(3)C57小鼠METH亚急性中毒模型大脑额叶SUMO-1、α-Syn表达量相较于对照组,分别上升了 1.69倍和2.06倍,具有显著差异;纹状体区SUMO-1、α-Syn表达量相较于对照组,分别上升了 2.14倍和1.56倍,具有显著差异。2、METH诱导体内外实验中α-Syn类泛素化水平变化:(1)以浓度梯度METH处理SH-SY5Y细胞24h,随着浓度升高,α-Syn类泛素化水平呈下降趋势,2.5mmol/L METH处理SH-SY5Y细胞24h,α-Syn类泛素化水平下降了 59.6%,具有显著差异;(2)以浓度梯度METH处理原代神经元细胞24h,随着浓度升高,α-Syn类泛素化水平呈下降趋势,1.Ommol/L METH处理原代神经元细胞24h,α-Syn类泛素化水平下降了 64.9%,具有显著差异;(3)C57小鼠METH亚急性中毒模型大脑额叶与纹状体区α-Syn类泛素化水平分别下降了 60.7%和54.6%,具有显著差异。3、METH诱导体外实验中关键酶变化情况:以浓度梯度METH处理SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞24h,随着浓度升高,E1酶SAE1、E3酶PIAS1和去类泛素化酶SENP-1表达无明显变化,而E2酶UBC9表达则呈下降趋势,具有显著差异;4、在体外实验中过表达UBC9对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响:(1)在SH-SY5Y细胞中过表达UBC9,相较于对照组,过表达组UBC9水平上升1.8倍,α-Syn类泛素化水平上升了 1.49倍,METH+UBC9组相较于METH组α-Syn水平降低了 27.2%、α-Syn聚集水平降低了 33.1%,具有显著差异;(2)在原代神经元细胞中过表达UBC9,相较于对照组,过表达组UBC9水平上升1.44倍,α-Syn类泛素化水平上升了 1.57倍,METH+UBC9组相较于METH组α-Syn水平降低了 37.4%,具有显著差异。5、在体外实验中沉默SUMO-1对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;(1)在SH-SY5Y细胞中沉默SUMO-1,相较于阴性对照组,α-Syn类泛素化水平下降38.8%,当METH与siSUMO-1共同处理细胞时,α-Syn类泛素化水平则下降66.1%,METH+siSUMO-1组相较于METH组α-Syn表达水平升高了1.7倍,α-Syn聚集水平升高了 1.5倍,具有显著差异;(2)在原代神经元细胞中沉默SUMO-1,相较于阴性对照组,α-Syn类泛素化水平下降了 70.1%,当METH与LV-SUMO-1-iRNA共同处理细胞时,α-Syn类泛素化水平则下降85.7%,METH+LV-SUMO-1-iRNA组相较于METH组α-Syn水平上升了 1.23倍,具有显著差异。6、在SH-SY5Y细胞中定点突变α-Syn类泛素化位点对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响:(1)相较于阴性对照组,LV-WT-α-syn组和LV-α-syn-2KR组α-Syn表达水平分别为 1.74 倍和 1.57 倍;相较于 LV-WT-α-syn 组,LV-α-syn-2KR 组 α-Syn 类泛素化水平降低61.6%,具有显著差异;LV-GFP+METH组与LV-WT-α-syn+METH组α-Syn表达和聚集水平无明显差异,但LV-α-syn-2KR组Ω-Syn表达和聚集水平则分别比LV-WT-α-syn+METH组高1.21倍和1.25倍,具有显著差异;(2)分别在稳定表达LV-WT-α-syn和LV-α-syn-2KR的细胞株给予METH处理的同时过表达UBC9,相较于WTα-syn+METH组,WTα-syn+METH+UBC9组α-Syn类泛素化水平上升1.71倍,α-Syn表达水平降低了 22.7%,具有显著差异。而相较于 α-syn-2KR+METH 组,α-syn-2KR+METH+UBC9 组 α-Syn 类泛素化和α-Syn表达水平均无明显变化。(3)相较于对照组,随着METH处理浓度增加,泛素蛋白酶体降解途径相关蛋白UbE1呈下降趋势而Ub呈上升趋势,自噬溶酶体降解途径相关蛋白LC3-II,P-62 和 LAMP2A 均呈上升趋势。相较于 WTα-syn+METH 组,α-syn-2KR+METH组 UbE1 与 UbE1/Ub 分别下降了 45.3%与 74.5%,LC3-II,P-62 和 LAMP2A 则分别上升了 2.01倍,1.62倍与2.53倍,具有显著差异。7、C57小鼠METH亚急性中毒模型中定点突变α-Syn类泛素化位点对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响。(1)相较于阴性对照组,AAV2-WT α-syn 组和 AAV2-α-syn-2KR 组 α-Syn表达水平分别上升2.02倍和2.81倍,具有显著差异;(2)相较于 AAV2-WT α-syn 组,AAV2-α-syn-2KR 组 α-Syn 类泛素化水平下降44.2%,具有显著差异;相较于AAV2-WT α-syn+METH组,AAV2-α-syn-2KR+METH组α-Syn类泛素化水平下降62.8%,具有显著差异;(3)AAV2-α-syn-2KR+METH 组相较于 AAV2-WT α-syn+METH 组,α-Syn表达水平上升1.79倍,具有显著差异;(4)相较于对照组,在小鼠METH亚急性中毒模型的大脑纹状体区,UbE1呈下降趋势而Ub呈上升趋势,同时LC3-II,P-62和LAMP2A均呈上升趋势,具有显著差异;AAV2-α-Syn-2KR+METH 组相较于 AAV2-WT α-Syn+METH 组,UbE1 与 UbE1/Ub 分别下降了 55.0%与 71.7%,LC3-II,P-62 和 LAMP2A 则分别上升了 2.22倍、1.40倍与1.30倍,具有显著差异,进一步验证体外实验中的结果。结论:体内外模型中,METH导致SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集水平上升,并且通过下调UBC9,降低α-Syn类泛素化水平而发挥神经毒性作用。过表达UBC9升高α-Syn类泛素化水平,缓解METH导致的α-Syn高表达和异常聚集;沉默SUMO-1降低α-Syn类泛素化水平,加剧METH导致的α-Syn高表达和异常聚集。体内外模型中特异性突变α-Syn类泛素化位点K96/102R降低α-Syn类泛素化水平,加剧METH导致的α-Syn高表达和异常聚集,加剧METH导致的α-Syn通过自噬溶酶体途径和泛素蛋白酶体途径降解障碍。因此,α-Syn类泛素化在METH的神经毒性机制中起到保护作用,通过调控α-Syn类泛素化,能够缓解METH相关神经毒性作用。