研究背景心血管疾病是世界范围内致病率和死亡率的主要原因,包括高血压、血脂异常、冠心病等,而动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是这些心血管疾病的共同发病基础。动脉粥样硬化是指在动脉及其分支的动脉壁内膜及内膜下有脂质沉着(主要是胆固醇及胆固醇脂),同时伴有中层平滑肌细胞移行至内膜下增生,使内膜增厚,形成黄色或灰黄色状如粥样物质的斑块。高血脂作为AS的始动疾病一直是相关研究的热点,而动脉壁内皮损伤及脂质的沉积是目前公认的AS始动因素[2]。Ross的炎性反应学说认为,动脉粥样硬化经历了从泡沫细胞、脂质条纹到纤维斑块、复杂斑块形成的过程,而动脉慢性炎症则是贯穿该过程的病生基础。巨噬细胞是参与动脉粥样硬化过程的主要炎症细胞,它通过清道夫受体吞噬氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, OxLDL)转变成泡沫细胞,沉积在动脉内膜下形成粥样硬化斑块。脂质被组织代谢过程中产生的氧自由基氧化形成氧化型低密度脂蛋白,被巨噬细胞吞噬从而成为泡沫细胞,又称为巨噬细胞源性泡沫细胞,这种细胞可增加脂质沉积,减少胆固醇的运出,促进脂肪条纹的形成,并成为AS进一步发展的潜在可能点。炎症是形成动脉粥样硬化的基础,因此,减少巨噬细胞源性的泡沫细胞,阻止脂质沉积成为脂肪条纹,抑制炎症的发生与进展对于AS的防治有非常重要的作用。近年来,自噬(Autophagy)开始成为细胞死亡方式研究的热点。自噬是指膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体,并与内涵体形成所谓的自噬内涵体,最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞稳态和细胞器的更新。目前普遍认为自噬是一种防御和应激调控机制。细胞可以通过自噬和溶酶体,消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质与核酸等生物大分子[7]。凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号,环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程,其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。自噬是细胞内的一种“自食”的现象,凋亡是“自杀”的现象,因此一般说来,凋亡是程序化细胞死亡,自噬是程序化细胞存活。但是过多或过少的自噬却危害细胞。某些情况下,自噬可引起细胞死亡,二者共用相同的刺激因素和调节蛋白,但是诱发阈值和门槛不同,如何转换和协调目前还不清楚。基于以上研究背景,我们的实验将围绕芹菜素所引起的死亡机制进行研究,并对凋亡与自噬的关系进行初步的探讨。芹菜素(Apigenin)是一种天然的黄酮类化合物,主要来源于伞形植物旱芹叶,也存在于多种中药当中,如紫花地丁、玄参、密蒙花等具有清热解毒功效的中药中都已经被检测出含有一定比例的芹菜素。芹菜素的药理作用包括抗炎、抗肿瘤、神经保护、调节免疫等作用。芹菜素具有多种生物学活性和药理作用,在体外以及体内众多的哺乳动物系统中的芹菜素的生物效应与其抗氧化作用及其清除作用自由基有关。此外,它还具有抗突变、抗炎、抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、放化疗增敏等作用。我们在前期的动物实验中发现,芹菜素能减少载脂蛋白E敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)动脉粥样斑块的面积,提示芹菜素对动脉粥样硬化有一定的防治作用,而且这种作用可能与减少巨噬细胞源性泡沫细胞的数量有关。同时,我们在研究芹菜素对结直肠癌的研究中发现,芹菜素可有效抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭转移及干扰肿瘤细胞的信号途径等,这给了我们提示,芹菜素是否可以通过诱导炎症细胞的凋亡、抑制其增殖,从而改善动脉粥样硬化的形成,同时,如果芹菜素可以诱导炎症细胞凋亡,是否还会诱导其他死亡方式?这都给了我们此课题新的思路与研究方向。基于以上研究背景,我们的实验将围绕芹菜素所引起的死亡机制进行研究,并对凋亡与自噬的关系进行初步的探讨。因此,本课题主要通过动物和细胞水平,即建立动脉粥样硬化动物模型和原代巨噬细胞培养,来研究芹菜素在抗动脉粥样硬化过程中对巨噬细胞源性泡沫细胞的死亡方式的影响及其作用机制。方法1.芹菜素对小鼠动脉粥样硬化的影响选用ApoE基因敲除小鼠,持续以高脂饲料喂养,随机分为2组(模型组,芹菜素组),加上正常C57小鼠作为对照的正常组,共3组,每组6只,8周龄时,芹菜素组以灌胃方式给药,喂养8周后,处死所有小鼠,取各组小鼠主动脉、小鼠腹腔巨噬细胞行油红O染色检测,主动脉作冰冻切片进行免疫荧光检测,观察芹菜素对小鼠动脉粥样硬化斑块的影响。2.F4/80标记巨噬细胞流式检测腹腔灌洗法巨噬细胞纯化率取正常C57小鼠4只,用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为2组：对照组和F4/80组,F4/80染色后上流式检测染色率,以检测巨噬细胞纯化率。3.芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞活力的影响1)用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为3大组：对照组(Control, C组),OxLDL 25μg/ml(O)组,芹菜素加OxLDL 25μg/ml(O+A)组,其中芹菜素组再分为3小组：10μM,25μM,50M,每组6孔。分别培养12小时,24小时,48小时,MTT法检测细胞活性,并选出芹菜素最佳作用时间和作用浓度进行后续实验。2)加入z-VAD检测芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞活力的影响。3)加入3-MA检测芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞活力的影响。4.芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响1) Annexin V-FITC/PI流式细胞凋亡检测：将原代小鼠腹腔巨噬细胞随机分6小组：DMSO(DMSO为芹菜素的溶剂)组,O组,O+A组,芹菜素+OxLDL +3-MA (O+A+M)组,芹菜素组(A)和3-MA(M)组。使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒,按说明书操作,经FACSCalibur流式细胞仪检测,观察芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响。2)TUNEL/DAPI染色法：原代小鼠腹腔巨噬细胞按上述分组,使用TUNEL凋亡检测试剂盒,按说明书操作,观察前用DAPI染核,在荧光显微镜下观察并拍照记录。5.MDC染色法检测自噬小体用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机按前述分组,MDC染色细胞,按照文献中方法操作,于荧光显微镜下观察并拍照记录。6. Western blot法分析芹菜素对自噬蛋白、凋亡蛋白及其两者关系表达的影响用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为： (1)4组：对照组,OxLDL组,芹菜素+OxLDL组,芹菜素+OxLDL +z-VAD (A+O+Z)组。(2)6组,即前述分组。Western blot的操作按本实验室常规步骤进行,在KODAK Image Station 4000MM Digital Imaging System中曝光成像,用Image J图像分析软件分析目的条带的灰度值,检测芹菜素对自噬蛋白如LC3B、Beclin-1等、凋亡蛋白如Caspase-3、Bax、Bcl-2表达的调控。7. ELISA法检测炎症因子的表达1)动物水平：采用ELISA方法检测小鼠血清肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin 1,IL-1β)白介素-6(Interleukin 6, IL-6)的蛋白水平。2)细胞水平：采用ELISA方法检测细胞培养上清(芹菜素作用时间分组为6,12,24小时)中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。3)加入z-VAD检测炎症因子TNF-α的表达变化。8.油红O染色检测泡沫细胞1)腹腔灌洗法取动物实验中各组小鼠腹腔巨噬细胞,通过油红O染色检测视野范围内红色脂肪滴比例。2)取动物实验中各组小鼠主动脉进行油红O染色,检测脂肪染色。9.统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析,结果表示为：均数士标准差(x±S)。多组间比较单因素分析采用OneWay-ANOVA,多因素采用析因设计资料的方差分析,方差齐时,两组比较采用LSD,当方差不齐时,采用Welch稳健估计,再采用Dunnett’s T3方法两两比较。P<0.05表示有统计学意义。结果1.芹菜素有效改善小鼠动脉粥样斑块面积取动物实验中各组小鼠主动脉进行油红O染色,芹菜素组相比于模型组红色阳性区域面积明显减少,两者比较差异有统计学意义(P=0.000)。2.芹菜素有效降低细胞炎症因子的表达在动物水平,芹菜素组与模型组相比,细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的表达明显降低,与模型组比较差异有统计学意义(F--871.813,P=0.000),IL-6的表达差异则无统计学意义(P=0.523)。在细胞水平,O+A组与O组相比,TNF-a的表达水平在芹菜素作用6小时已明显降低,两者比较差异有统计学意义(P=0.001),而IL-1β、IL-6的表达水平在芹菜素作用12小时开始明显降低,两者比较差异有统计学意义(P=0.001)。3.油红O染色检测芹菜素明显抑制巨噬细胞转化为泡沫细胞腹腔灌洗法取动物实验中各组小鼠腹腔巨噬细胞,通过油红O染色检测视野范围内,芹菜素组相比于模型组红色脂肪滴比例明显降低,两者比较差异有统计学意义俨0.000)。4.MTT法检测芹菜素在浓度为25μM、作用时间为48h时细胞致死率为IC50MTT结果表明,芹菜素在作用25μm 48h时,A组与O+A组相比活力有显著差异(F=425.521,P=0.000),达到半数致死率IC50,并且随着时间和浓度的增加,A组与O+A组相比,细胞活力逐渐降低。5.ELISA检测芹菜素作用不同时间点对细胞炎症因子表达的影响O+A组与O组相比,TNF-α的表达水平在芹菜素作用6小时已明显降两者比较差异有统计学意义(P=0.000),而IL-1β、IL-6的表达水平在芹菜素作用12小时开始明显降低,两者比较差异有统计意义(P=0.000)。6.加入Caspase-3抑制剂z-VAD可以抑制芹菜素对细胞活力的影响,并且阻断芹菜素对细胞炎症因子TNF-a表达的影响MTT结果表明,O+A+Z组细胞凋亡率显著高于O+A组,同时O+A+Z组中细胞上清细胞炎症因子TNF-a的表达较O+A组水平升高(P=0.000)。7.流式细胞技术分析芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响,说明芹菜素诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡O组与O+A组相比细胞凋亡率有显著差异(F=210.261,P=0.001), O+A组细胞凋亡率显著高于DMSO组与O组。加入自噬抑制剂3-MA后,O+A+M组细胞凋亡率,O+A+M组与O+A组相比细胞凋亡率有明显提高(P=0.000)8.MDC染色检测芹菜素诱导自噬小体产生,说明芹菜素诱导巨噬细胞源性泡沫细胞自噬MDC染色结果显示：与O组相比,O+A组染上为显示绿色颗粒状、点状聚集的自噬小体显著增加,差异有统计学意义(P=0.000)。与O+A组相比,O+A+M组自噬小体表达降低,差异有统计学意义(P=0.000),表明自噬得到抑制。9. Western blot法检测芹菜素诱导凋亡蛋白表达,说明芹菜素诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡与O组相比,在O+A组Caspase-3片段化增强,差异有统计学意义(P=0.000)。与O+A组相比,O+A+Z组Caspase-3片段化减弱,两者差异有统计学意义(P=0.000)。10. Western blot法检测芹菜素诱导自噬蛋白表达,说明芹菜素诱导巨噬细胞源性泡沫细胞自噬与O组相比,在O+A组LC3BⅡ、Beclin-1、Atg-7、Atg-5表达均增加。与O+A组相比,O+A+M组LC3BⅡ、Beclin-1、Atg-7、Atg-5表达均降低。11.抑制自噬后,芹菜素诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡增加MTT结果表明,加入自噬抑制剂3-MA后细胞活力相比于芹菜素组有升高；流式结果表明,O+A+M组与O+A组相比细胞凋亡率有显著提高(P=0.000)；TUNEL法检测结果表明,O+A+M组与O+A组相比细胞凋亡率有显著提高(P=0.000),O+A+M细胞凋亡率显著高于O+A组。Western blot法检测结果表明,O+A+M组与O+A组相比,Caspase-3片段化增强,Bax/Bcl-2比例增加(P=0.000)。结论1芹菜素能改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变。2芹菜素能诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡从而降低动脉粥样硬化病变过程中炎症因子的表达。3芹菜素可诱导巨噬细胞源性泡沫细胞发生自噬,抑制自噬后,芹菜素诱导巨噬细胞源性泡沫细胞发生凋亡的水平增加。