【摘 要】
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研究背景:原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,致死率排在所有恶性肿瘤的第三位。肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是成年人PLC中最常见的类型。我国是乙型病毒性肝炎及肝癌大国,患者数量占全世界的半数以上。肝脏移植、手术切除和局部射频消融是目前治疗HCC的主要治愈性手段,但是,HCC的早期复发和转移使得HCC的无
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81872385）；
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研究背景:原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,致死率排在所有恶性肿瘤的第三位。肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是成年人PLC中最常见的类型。我国是乙型病毒性肝炎及肝癌大国,患者数量占全世界的半数以上。肝脏移植、手术切除和局部射频消融是目前治疗HCC的主要治愈性手段,但是,HCC的早期复发和转移使得HCC的无瘤生存及术后生存率不尽人意。因此,揭示HCC的发生发展过程及研究其转移复发的作用机制,是目前HCC研究领域的焦点。肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）的存在是导致肿瘤转移复发的重要危险因素。众多的研究表明肝癌细胞中所存在的肝癌干细胞（Liver cancer stem cells,LCSCs）,是导致HCC转移复发的主要因素。CSCs具有自我更新、耐药和抗细胞凋亡的功能,从而易于引起肿瘤的转移复发。目前的研究表明,上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）在调节CSCs特性方面起到重要的作用。我们的前期研究发现长链非编码RNA linc00261可以抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。本研究在前期研究的基础上进一步探究linc00261对肝癌EMT进程及干细胞特性的影响,探讨linc00261对肝癌EMT进程及干性特征的作用机制,最后阐明linc00261在HCC中表达沉默的原因及与相关蛋白的相关性分析,进一步说明linc00261表达水平对HCC患者预后的影响。研究方法:1.在人类肝癌细胞系中稳定转染过表达linc00261和小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）敲低linc00261,采用qRT-PCR验证其过表达效率和敲低效率。采用qRT-PCR和Western-Blotting技术检测linc00261对肝癌细胞系EMT及干性标志物表达水平的影响。2.对过表达linc00261后的肝癌细胞系SMMC-7721进行体外肿瘤成球实验,连续体外培养14天,显微镜观察linc00261对肝癌细胞系体外成球能力的影响;将过表达linc00261及空白对照组的细胞注射到重度联合双免疫缺陷小鼠皮下,观察linc00261对肝癌细胞皮下成瘤能力的影响;利用qRT-PCR和免疫组化技术检测成瘤组织中EMT及干性标志物表达水平的差异。3.进一步研究linc00261抑制肝癌细胞EMT及干性特征的机制。采用Trannswell小室实验探究linc00261对肝癌细胞系侵袭能力的影响;采用Western-Blotting 检测 linc00261 对 EMT 标志物的影响。采用 qRT-PCR 和 Western blotting技术检测linc00261对TGF-β信号通路下游核心转录因子SMAD3表达水平的影响。4.阐明linc00261表达沉默的原因机制,并对其与相关蛋白进行共表达分析。采用CHIP-qPCR证实linc00261表达下调的机制;采用免疫组织化学技术研究linc00261与相关蛋白的共表达关系。研究结果:1.肝癌细胞系在敲低linc00261后,除E-cadherin外的EMT及干性标志物的表达水平明显高于对照组;过表达linc00261后,除E-cadherin外的EMT及干性标志物的表达水平明显低于空白对照组。表明linc00261影响HCC患者的预后可能通过影响肝癌细胞的EMT进程和干性特征而起作用。2.Linc00261可以抑制肝癌细胞体外成球能力及体内成瘤能力,成瘤组织中过表达linc00261组的EMT及干性相关转录因子的mRNA及蛋白表达水平明显低于空白对照组,干性表面标志物及EMT间质标志物蛋白表达水平明显下调,而上皮标志物E-cadherin的蛋白表达水平明显上调。3.linc00261在肝癌细胞中抑制TGF-β信号通路下游核心转录因子Smad3的总蛋白表达水平、磷酸化水平及抑制Smad3蛋白的核转运过程。linc00261可能通过影响TGF-β信号通路而影响肝癌细胞的EMT进程及干性特征。4.EZH2通过介导组蛋白甲基化而沉默linc00261的表达;linc00261在HCC组织中与EZH2、H3K27Me3及P-SMAD3呈现明显的负相关关系。结论:我们的研究结果表明EZH2介导的组蛋白甲基化使得linc00261在HCC中表达沉默,linc00261通过抑制TGF-β信号通路而阻止肝癌细胞的EMT进程和干性特征的获得,从而抑制肝癌细胞的自我更新能力和侵袭能力,最终影响HCC患者的预后。
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