自1978年美国食品和药物管理局（FDA）正式批准以来,顺铂已成为临床上广泛使用的抗肿瘤化疗药物,应用于多种肿瘤的临床治疗。然而,长期使用顺铂治疗可导致患者发生严重的药物毒副作用,包括骨髓抑制、耳毒性、肾毒性及急性药物过敏反应等毒副作用。临床上,顺铂的药物毒副作用大大限制了该药的使用,减少了肿瘤患者的治疗机会。研究发现,单剂量的顺铂（50-100mg/m2）治疗有20-35%的患者发生急性肾损伤（AKI）。在顺铂致AKI过程中,肾小管上皮细胞损伤与炎症反应是其中关键性的病理机制,急性肾小管坏死是AKI的特征性改变。坏死的肾小管上皮细胞周围可见大量炎症细胞浸润,浸润的炎症细胞又会进一步加重肾小管上皮细胞的损伤。单核巨噬细胞作为存在于肾小管间质中的炎症细胞与肾小管上皮细胞间存在密切的联系,在肾小管上皮细胞损伤后几小时内可浸润于受损伤肾小管上皮细胞周围,释放TNF、IL-6及IL-1 β等炎症因子作用于肾小管上皮细胞,同时释放趋化因子诱导更多炎症细胞浸润。上述细胞坏死及炎症反应属于无菌性炎症反应过程,这一反应过程存在于包括AKI在内的多种疾病的病理生理过程中,其中细胞坏死所释放的内源性信号分子（如DAMPs）对于固有免疫系统的激活是无菌性炎症反应的中心环节。固有免疫系统对于DAMP的识别主要是通过存在于单核巨噬细胞及树突状细胞的受体完成的。坏死的肾小管上皮细胞可释放出DAMP作用于间质内的单核巨噬细胞上的PRR,激活单核巨噬细胞启动无菌性炎症反应。NOD样受体是一种存在于单核巨噬细胞内的PRR,NLRP3炎症小体是NOD家族中最为重要及研究最为深入的PRR,而NLRP3炎症小体活化后可致IL-1β及IL-18释放。在AKI进程中,阻断IL-1 β及IL-18可显著减轻肾小管上皮细胞损伤。在AKI中受损伤肾小管上皮细胞可释放多种DAMPs激活NLRP3炎症小体,其中研究较为深入的是HMGB1及ATP。我们既往的研究发现清除胞外ATP及阻断巨噬细胞表面的P2X受体可抑制顺铂损伤肾小管上皮细胞对巨噬细胞炎症小体的激活。但我们既往的研究对于顺铂损伤肾小管上皮细胞致巨噬细胞炎症小体激活的详细机制仍存在以下疑问:1.损伤肾小管上皮细胞激活了巨噬细胞内何种炎症小体?2.在肾小管上皮细胞与巨噬细胞交互过程中发挥重要作用的ATP来源是什么?是由肾小管上皮细胞释放的ATP?亦或巨噬细胞自分泌来源的ATP?近年来对于在无菌性炎症反应中作为DAMPs的ATP的来源及作用机制有了更为深入的认识。ATP是一种可由损伤细胞释放的DAMPs,而巨噬细胞在MSU、ablum、HMGB1、ATP等的刺激下也可释放ATP至胞外。ATP自巨噬细胞的释放主要通过细胞表面的Pannexin-1通道,释放出胞外的ATP又可与巨噬细胞表面的P2X7受体结合调控炎症小体的活化。ATP、Pannexin-1及P2X7即构成了巨噬细胞炎症小体活化的一条重要的调控通路。基于以上研究背景,我们提出本研究的科学假说:1、顺铂损伤的肾小管上皮细胞可以上调巨噬细胞表面的Pannexin-1通路,促进巨噬细胞释放出ATP与P2X7受体结合,使得巨噬细胞内的炎症小体被激活;2、阻断肾小管上皮细胞对于巨噬细胞Pannexin-1通路的上调及P2X7受体的活化可减轻顺铂致AKI时肾组织内炎症反应,从而对肾组织发挥保护作用。1、体内及体外实验证实损伤肾小管上皮细胞可激活巨噬细胞炎症小体释放IL-1 β目的:通过体内外实验,探讨顺铂损伤的肾小管上皮细胞是否可以激活巨噬细胞内炎症小体。方法:1、使用顺铂（20uM）刺激NRK-52E细胞6小时后,换无药物培养基再培养,收取48小时的上清为条件培养基,以条件培养基刺激PMA分化的THP-1细胞,通过免疫印迹、ELISA检测IL-1 β的分泌水平与Caspase活化状态;2、将条件培养基浓缩后,注射入小鼠腹腔,12小时后收取腹腔灌洗液;通过细胞涂片、流式细胞学、ELISA等检测灌洗液内炎症细胞的浸润与IL-1 β的水平.结果:1、体外实验观察到:条件培养基可刺激THP-1细胞后Caspase-1活化以及IL-1 β分泌明显增多。2、体内实验证实,条件培养基刺激腹腔后可诱导F4/80+CD11b+炎症细胞浸润,且IL-1 β分泌明显升高。小结:顺铂损伤的肾小管上皮细胞可通过激活巨噬细胞内炎症小体致IL-1 β分泌。2、顺铂损伤肾小管上皮细胞特异性激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体目的:探讨顺铂损伤的肾小管上皮细胞激活巨噬细胞内何种炎症小体致IL-1β分泌。方法:1、使用条件培养基刺激PMA分化的THP-1细胞,通过PCR检测NLRP3、NLRP1、AIM2、NLRC4的表达水平;2、使用条件培养基刺激THP-1、Def-NLRP3 THP-1、Def-ASC THP1细胞,收取细胞上清通过免疫印迹和ELISA检测IL-1 β分泌水平。结果:1、条件培养基刺激的THP-1细胞后,NLRP3的mRNA水平特异性升高,而NRLP1、NLRC4、AIM2等均未有升高;2、下调THP1细胞内NLRP3、ASC的表达,观察到条件培养基致IL-1 β分泌的作用明显下降。小结:顺铂损伤的肾小管上皮细胞可通过特异性激活巨噬细胞内NRLP3炎症小体致IL-1 β分泌。3.顺铂损伤肾小管上皮细胞上调及活化巨噬细胞表面的Pannexin-1通路及P2X7受体目的:探讨顺铂损伤的肾小管上皮细胞通过何种途径激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体。方法:1、使用ATP酶Apyrase预处理小鼠,再腹腔注射条件培养基诱导腹膜炎,提取腹腔灌洗液,通过ELISA检测IL-1 β分泌水平;2、使用条件培养基刺激THP-1细胞,通过免疫印迹、免疫荧光等检测细胞内P2X7受体和Pannexin-1通道的表达及上清内ATP的水平;3、使用Pannexin-1通道抑制剂Probenecid、CBX预处理THP-1细胞后,再予条件培养基刺激,检测上清内ATP水平。结果:1、体内腹膜炎实验,在清除了 ATP后条件培养基致炎症细胞分泌IL-1β的作用明显降低;2、条件培养基刺激THP-1细胞后,可致细胞内Pannexin-1通道表达上调致ATP释放到胞外,并激活P2X7受体;3、抑制Pannexin-1通道可抑制条件培养基致THP-1细胞释放ATP。小结:可见,顺铂损伤的肾小管上皮细胞可上调巨噬细胞内Pannexin-1通道,致胞内ATP释放至胞外激活P2X7受体。4.阻断pannexin-1通路及P2X7受体可抑制顺铂损伤肾小管上皮细胞对巨噬细胞NLRP3炎症小体的激活目的:探讨巨噬细胞受刺激后释放的ATP与巨噬细胞分泌IL-1 β间的关系。方法:使用 Pannexin-1 抑制剂 Probenecid、CBX、Trovafloxacin 与 P2X7 受体抑制剂Suramin预处理THP-1细胞后,加入条件培养基刺激,通过免疫印迹与ELISA检测上清内IL-1 β的分泌水平。结果:使用 Pannexin-1 抑制剂 Probenecid、CBX、Trovafloxacin 或 P2X7 受体抑制剂Suramin预处理THP-1细胞后,均可明显抑制THP-1细胞分泌IL-1 β。小结:结合上一章节结果,考虑通过Pannexin-1通道分泌至胞外的ATP可激活P2X7受体为巨噬细胞提供第二信号,再激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体致IL-1 β分泌。5.在顺铂致AKI小鼠模型中干预pannexin-1通路及P2X7受体可抑制肾组织炎症反应及减轻肾小管上皮细胞的损伤目的:在顺铂致AKI小鼠模型上,通过干预探讨Pannexin-1通道及P2X7受体的上调在急性肾损伤中与肾脏炎症和肾组织损伤间的关系。方法:分别于注射顺铂（20mg/kg）之前前30分钟与之后24小时、48小时,腹腔注射 Suramin（20mg/kg）、CBX（20mg/kg）抑制 P2X7 受体与 Pannexin-1 通道,注射顺铂72小时后牺牲小鼠收取标本。取血浆检测Cr和BUN,取组织通过PCR检测NLRP3、IL-1 β、Kim-1、NGAL、Ki76等mRNA表达水平和通过免疫荧光检测F4/80+细胞浸润情况。结果:予以阻断剂处理后,可明显改善肾功能指标Cr、BUN和细胞增殖指标Ki67明显上调,肾小管损伤标志物Kim-1、NGAL下调,且组织内NRLP3、IL-1 β的mRNA表达水平明显下降。同时,发现Suramin、CBX处理后,组织内F4/80+细胞浸润水平下降。小结:在顺铂致AKI小鼠模型中干预pannexin-1通路及P2X7受体,可明显改善顺铂致急性肾损伤时的肾功能恶化、炎症浸润与肾小管损伤。结论顺铂损伤的肾小管上皮细胞可特异性激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体,顺铂损伤的肾小管上皮细胞可上调巨噬细胞表面的Pannexin-1通路,使得巨噬细胞释放ATP与膜表面P2X7受体结合,进而激活NLRP3炎症小体。顺铂致AKI模型上,阻断巨噬细胞表面Pannexin-1通路及P2X7受体可减轻顺铂所致肾组织内炎症反应及保护肾小管上皮细胞。