部分缺失或重复是常见的染色体不平衡畸变,常与先天多发性畸形、发育迟缓和智力低下有关。传统的染色体检查方法为G显带染色体核型分析技术,虽然可以检测整套染色体的数目和明显的结构异常,但其分辨率有限,对于片段长度小于5Mb的不平衡畸变则难以检出。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)尽管可以验证已知的或疑似的亚显微缺失和重复,但无法诊断没有任何确定条带模式的未知染色体异常。光谱核型分析技术(spectral karyotypin,SKY)通过24色光谱探针与中期染色体杂交可以判定明显的染色体异位和标记染色体的来源,但对于同一条染色体内部的异常则不能作出诊断。微阵列比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization,array-CGH或aCGH)是新近发展起来的一种高效的分子核型分析技术,其优势在于避开中期染色体,直接在DNA水平上进行诊断。Array-CGH通过一次杂交实验就能够对全基因组DNA拷贝数变异(copy number variants,CNVs)进行高通量、高分辨率分析,快速、精确地检测到DNA拷贝数的多寡,并能将某一DNA序列变异准确定位到染色体上,因此最适合于诊断染色体的微缺失或重复。Array-CGH技术将染色体病的诊断提高到基因水平上,指导临床遗传咨询医师对基因型-表型关系进行分析,准确评估病情和预后。本研究是国内首次应用array-CGH技术诊断和产前诊断染色体不平衡畸变病例。一、目的1.建立微阵列比较基因组杂交技术( array-based comparative genomic hybridization,array-CGH or aCGH),探讨array-CGH技术在不平衡染色体畸变的诊断和产前诊断中的应用价值。2.探讨array-CGH诊断不平衡染色体畸变的准确性和灵敏性。3.探讨aCGH技术与G显带、FISH技术,SKY技术,以及C显带等其他显带技术在诊断不平衡染色体畸变中如何有效结合,建立理想的实验室诊断规范。二、对象与方法1.研究对象选取2008年1月至2009年12月期间在广州市妇女儿童医疗中心优生围产研究所遗传咨询门诊就诊或外院转诊,行染色体检查的病例21例。包括外周血19例,产前诊断的羊水1例、胎儿脐带血1例。21例病例中,4例为正常对照;其余17例为疑似染色体异常的患者,但是经常规G核型分析均未能明确诊断。2、方法(1)将21例样本按SNP 6.0芯片的标准操作常规进行杂交,并进行相应的扫描和计算机软件分析结果。(2)应用PCR技术、FISH及SKY技术对所有芯片检测结果进一步验证,从而鉴定array-CGH技术诊断染色体不平衡畸变的灵敏度和准确性。(3)用C显带和银染技术对2例疑发生在异染色质区域的重复变异行进一步分析诊断,以协助评估病情和预后。(4)探索array-CGH如何与FISH、SKY、G显带、C显带等其他各种染色体显带分析技术联合作用,建立标准的实验室诊断流程。3、随访对所有产前诊断病例常规进行随访。三、结果1.21个样本均成功进行了array-CGH技术分析:对G显带不能明确诊断的17例患者均在DNA水平上明确了诊断,所有病例均发生了基因组大片段的DNA拷贝数变异。4例正常对照样本未发现含有致病性的DNA拷贝数变异。2.病例1经G显带核型分析发现13号是环状染色体,但无法确定缺失条带[G显带核型为46,XY,r(13)(p10q34)?],array-CGH分析明确诊断为13号染色体长臂末端发生8.5Mb的缺失:46,XY,del(13)(q33.2→q34)。3.病例2、4、6经G显带核型分析均发现某条染色体额外增多了一部分物质,但是无法确定该物质的来源,其中病例4和病例6是父女关系。病例2为18号染色体长臂中间DNA拷贝数发生34 Mb的重复[G显带核型为46,XY,add(18)], aCGH确诊为46,XY,dup(18)(q12.3→q22.3)。病例4和病例6经G显带分析发现9号染色体长臂近端增多了条带,无法确诊。aCGH分析发现父女俩9号染色体横跨着丝粒两侧DNA发生遗传性30 Mb大小的重复片段,aCGH结果为46,XX,dup(9)(9p13→q13),pat。4.病例3和病例5其基因组DNA分别合并有重复和缺失的复杂DNA拷贝数变异。病例3经G显带核型分析发现8号染色体短臂增多了一部分物质,但是无法确诊[G显带核型为46,XY,add(8)],aCGH确诊为8号染色体短臂DNA不仅发生了重复,还同时合并缺失: 46,XY,dup(8)(p21.3-p11.3),de1(8) (p23.3→p23.1);病例5经G显带核型分析提示X染色体为衍生染色体,无法确定其畸变类型[G显带核型为46,X,der(X)], aCGH结果明确诊断为X染色体长臂DNA发生63.45 Mb的重复;合并短臂发生52.7 Mb的缺失:46,X,dup(X)(q21.31→q28),del(X) (p22.33→p11.22)。5.病例7—10均为女性患者,经常规G显带核型分析未发现异常,array-CGH技术分析发现这些患者的17号染色体长臂中间均发生了380 kb的微缺失:46,XX,del(17)(q21.31-q31.32)。6.病例11—15为女性患者,常规G显带染色体核型分析未发现异常,行array-CGH技术分析发现这五个病例的X染色体短臂末端均含有112 kb的微小缺失:46,XX,del(X)(p22.33)。7.病例16—17为产前诊断病例。病例16经G显带核型分析未发现异常,array-CGH分析发现该胎儿22号染色体长臂近端发生了700 kb的微小缺失:46,XY,del(22)(q11.2),结合B超提示胎儿心脏畸形,诊断为DiGeorge综合征,因该综合征往往伴发智力低下,孕妇终止妊娠;病例17为来自孕妇遗传的平衡易位,array-CGH分析未发现大片段的致病性DNA拷贝数变异,考虑到胎儿表型与正常表型的孕妇相似,建议继续妊娠;孕妇足月分娩一男婴,产后随访该男婴生长发育未见任何异常。8.所有aCGH技术检测结果均经PCR和FISH技术验证,并且验证结果与上述aCGH结果相吻合。一、结论1. Array-CGH技术是一种全新的现代化分子核型分析技术,是遗传学研究领域里的一项重大突破,将染色体病的诊断水平精确提高到基因水平上。其分辨率和准确性极高,有效地克服或弥补了现有的染色体诊断技术的局限性。2. Array-CGH技术避开中期染色体,直接将待测样本的DNA与微阵列上标准的人类全基因组裹核苷酸探针杂交,可以快速、准确地判断样本全基因组DNA拷贝数的多寡,并准确定位在染色体上,清楚显示DNA变异区段内的基因含量,具有FISH、SKY等所有以中期染色体为检测载体的技术所无法比拟的优势。3. Array-CGH技术应用于临床不平衡染色体病的诊断和产前诊断,可快速、准确地在分子水平上明确诊断,为临床遗传咨询医生进行基因型-表型关系的分析提供科学依据,有利于准确评估预后和指导妊娠结局。4. Array-CGH技术的突出特征是检测样本基因组DNA拷贝数变异(copy number variations, CNV),对于没有发生DNA拷贝数增减的染色体畸变(如平衡易位或平衡倒位)则具有一定的局限性,需要结合G显带和FISH技术进行分析。其次,对于aCGH技术检测得到的结果,需要遗传学工作者进行相应的生物信息数据库的查阅,以准确判断该CNV是致病性改变还是良性变异。5.对于不平衡染色体畸变的病例,理想的染色体分析操作流程是:首先运用G显带技术进行初步分析,其次行array-CGH检测以明确诊断。对于没有发生DNA拷贝数改变的平衡易位和平衡到位,再使用FISH技术或PCR行进一步核实。C显带和银染技术等则有助于验证发生在异染色质区域和随体组织的CNV,有助于协助诊断和评估预后。