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C6-C10乙基酯是酒中的重要呈香物质,能赋予酒特色的风味。酿酒酵母中C6-C10乙基酯合成是PDH旁路途经,该途径主要受乙酰CoA、丙二酸单酰CoA、中链酰基CoA影响。本研究首先从实验室现有的酿酒酵母中筛选产酯能力较高的酵母作为出发株。其次对筛选菌株进行乙酰CoA、丙二酸单酰CoA、中链酰基CoA合成代谢途径的强化及外源醇酰基转移酶基因的引入,以提高酿酒酵母产C6-C10乙基酯的能力。主要研究内容及结论如下:(1)出发菌株的筛选。将实验室现有酿酒酵母菌株CA、C01、AY12及AY12-α进行发酵实验,筛选得到产C6-C10乙基酯较高的菌株CA,其己酸乙酯为0.27 mg/L、辛酸乙酯为1.65 mg/L、癸酸乙酯为2.92 mg/L,用作后期分子改造的出发株。(2)强化乙酰CoA的合成以提高C6-C10乙基酯的含量。以筛选得到的菌株CA作为出发株,用强启动子分别及同时过表达与乙酰CoA合成途经直接相关的基因ADH2(乙醇脱氢酶)、ALD6(乙醛脱氢酶)和ACS1(乙酰CoA合成酶),得到单独过表达菌株 C-adh2、C-ald6、C-acs1 及同时过表达菌株 C-ald6acs1 和 C-adh2ald6acs1。CoA发酵结果表明,单独过表达ACS1菌株C-acs1其C6-C10乙基酯产量高于过表达ALD6菌株C-ald6和过表达ADH2菌株C-adh2,说明在提高乙酰CoA的含量中,ACS1基因效果优于ADH2、ALD6。同时过表达ALD6-A CS1菌株C-ald6acs1,其己酸乙酯的产量为0.79 mg/L,是出发菌株的2.54倍,辛酸乙酯的产量为8.45 mg/L,是出发株的6.93倍、癸酸乙酯的产量为7.87 mg/L是出发株的6.78倍;在出发株C-ald6acs1中进一步进行ADH2基因的过表达,其C6-C10乙基酯的含量几乎没有变化,说明ACS1和ALD6基因的组合效果较好,强化的乙酰CoA需要进一步转化为丙二酰单酰CoA,进一步为C6-C10乙基酯的合成提供更多的前体物质。(3)强化丙二酸单酰CoA的合成以提高C6-C10乙基酯的含量。分别整合及游离过表达乙酰CoA羧化酶基因ACC1*,对改造菌株进行发酵检测,结果表明整合过表达ACC1*菌株C-ald6acs1A*其辛酸乙酯达9.32 mg/L,较出发株C-ald6acs1提高了近1.36倍,以及癸酸乙酯产量达9.84 mg/L,为出发株C-ald6acs1的1.49倍;在此基础上进一步游离过表达ACC1*,C6-C10乙基酯产量没有明显提高,可能游离表达的不稳定,菌株生成的丙二酸单酰CoA需要进一步被催化以提高C6-C10乙基酯的含量。(4)进一步,实验通过过表达脂肪酸合成酶FAS1和FAS2以增强中链酰基CoA的合成。对改造菌株进行发酵实验,结果表明,在C-ald6acs1A*的基础上单独及同时过表达FAS1、FAS2,单独过表达FAS1菌株C-ald6acs1A*F1较出发株C-ald6acs1A*其己酸乙酯提高了 65.0%、辛酸乙酯提高了 19.3%、癸酸乙酯提高了 18.5%。单独过表达FAS2菌株C-ald6acs1A*F2其产量较菌株C-ald6acs1A*F1低一些。结果说明,过表达编码脂肪酸合成酶β亚基的FAS1提高C6-C10乙基酯效果优于FAS2。同时过表达FAS1-FAS2菌株C-ald6acs1A*F1F2分别较出发株C-ald6acs1A*其己酸乙酯提高了54.7%、辛酸乙酯提高了 41.5%、癸酸乙酯提高了 43.4%,产量分别达2.77 mg/L、11.19 mg/L 和 11.32 mg/L。(5)实验前期通过分子改造使代谢流更多的流向中链酰基CoA,进一步外源引入草莓中的醇酰基转移酶基因SAAT,得到改造菌株C-ald6acs1A*F1F2S,其己酸乙酯的产量为7.53mg/L,是出发菌株C-ald6acs1A*F1F2的2.72倍,是原始出发株CA己酸乙酯产量的25.89倍(仅0.27 mg/L),而辛酸乙酯和癸酸乙酯的产量分别是13.65 mg/L和13.89 mg/L,较原始出发菌CA提高了 7.00倍和8.78倍,说明醇酰基转移酶SAAT对己酸乙酯的特异性较辛酸乙酯和癸酸乙酯好,与文献中报道一致。