目的：通过基因工程手段构建重组pET-28α-Dclk1激酶结构域（kinasedomain；KD)质粒；建立高效表达的大肠杆菌E.coli原核表达系统；利用重组his-tag融合Dclk1(KD)蛋白特性设计纯化方案，获得高纯度Dclk1(KD)蛋白。利用纯化所得Dclk1(KD)蛋白进行小分子化合物高通量筛选，寻找潜在Dclk1(KD)抑制剂，并对其进行生物学抗炎活性研究，以期获得新的Dclk1(KD)抑制剂。
　　方法：1.将质粒pET-28α进行双酶切线性化后与Dclk1（372aa~650aa)重组连接，构建成重组质粒pET-28α-Dclk1(KD)。将质粒转化到DH5α中，卡那霉素抗性筛出阳性转化子，经菌落PCR后阳性转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。挑选经测序正确的转化子，抽提质粒pET-28α-Dclk1(KD)并转化到表达宿主E.coliC41(DE3）中，摇床37℃、180rpm培养至A600约0.6，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L。20℃低温诱导过夜,离心收集菌体，超声破菌后确认蛋白为包涵体表达。
　　2.通过包涵体变复性使Dclk1(KD)蛋白重新折叠，以可溶形式存在。基于Dclk1(KD)的分子量及融合his-tag特性，建立以镍柱亲和层析、凝胶过滤层析为基础的纯化手段。获得高纯度Dclk1(KD)蛋白后委托公司测活。
　　3.委托公司进行化合物对Dclk1(KD)活性抑制作用检测，通过检测不同小分子化合物对Dclk1(KD)酶活力的影响高通量筛选出潜在Dclk1(KD)抑制剂，并对其进行进一步生物学活性研究。
　　结果：1.合成Dclk1(KD)基因序列，并与表达载体pET-28α同源重组，测序验证得到阳性的pET-28α-Dclk1(KD)重组质粒。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌C41(DE3)感受态中。通过优化表达条件，使Dclk1(KD)成功表达。2.通过包涵体变复性使Dclk1(KD)蛋白重新正确折叠，基于Dclk1(KD)蛋白中融合表达的his-tag的Ni亲和性及不同蛋白之间分子量差异建立以镍柱亲和层析与凝胶过滤层析为基础的纯化手段，获得了高纯度且有活性的Dclk1(KD)蛋白。
　　2.利用高通量筛选出2个潜在Dclk1(KD)抑制剂，利用MTT法确定其最大安全剂量为5μmol/L，利用ELISA法证明其剂量依赖性地缓解LPS所致的细胞炎症反应。
　　结论：成功的利用大肠杆菌原核表达系统诱导表达重组Dclk1(KD)蛋白，并通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化获得>95%纯度且具有生物活性的重组Dclk1(KD)蛋白。基于Dclk1(KD)活性检测体系高通量筛选Dclk1(KD)抑制剂并进抗炎生物活性研究，以期获得新的靶向Dclk1(KD)蛋白的抗炎活性化合物。