脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis,B.f)是人和动物肠道中的共生菌,近来许多研究发现其在促进免疫系统成熟、抑制炎症反应及改善肠道菌群结构方面发挥重要作用,也因如此,脆弱拟杆菌在作为潜在的益生菌菌株方面可能具有良好的开发前景。副溶血弧菌(V.parahaemolyticus,V.p)为革兰阴性的嗜盐短杆菌,是一种重要的食源性致病菌,人消化道感染此菌后,患者症状可从自限性腹泻至中度霍乱样,会出现腹痛、腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐和低热等症状,患者粪便多为水样,少数为血水样,严重时患者可出现脱水、昏迷,但患者可恢复较快,病后免疫力不强,可重复感染。目前市面上的益生菌如乳酸杆菌、双歧杆菌等均有诸多促进人体健康的作用,例如治疗便秘,帮助消化、增强人体免疫力、缓解乳糖不耐受、减少抗生素使用后的菌群失调、防治细菌感染性腹泻及拮抗肠道致病菌。在此,我们选取了脆弱拟杆菌是否能拮抗副溶血弧菌进行研究。本论文主要包括以下两部分内容:第一部分脆弱拟杆菌抑制副溶血弧菌的体外实验1.脆弱拟杆菌抑制副溶血弧菌的牛津杯实验某些益生菌可以分泌抑制或者杀死肠道中及自然界中某些有害微生物生长的物质,而牛津杯法(管碟法)可用于检测益生菌的抑菌活力。我们用此方法观察脆弱拟杆菌是否有抑制副溶血弧菌的作用,结果发现:加入脆弱拟杆菌培养上清液的牛津杯周围存在副溶血弧菌的抑菌圈,但是加入脆弱拟杆菌活菌生理盐水重悬液、脆弱拟杆菌菌体裂解液的牛津杯周围未出现副溶血弧菌的抑菌圈,表明只有脆弱拟杆菌的培养上清液对于副溶血弧菌的生长存在抑制作用。2.脆弱拟杆菌抑制副溶血弧菌感染的细胞实验在正常人体肠道中,数量巨大的各种菌群占据了肠道细胞表面,外源性的致病菌很难再粘附于肠上皮并进一步定植,同时肠道正常菌群的营养争夺也限制了致病菌的生长,再加上某些肠道细菌也可以分泌抑制其他微生物生长的物质,所以,正常肠道菌群可以看作是抵御外来致病菌入侵的一道天然生物屏障。我们将脆弱拟杆菌加入到人结肠上皮肿瘤来源的LoVo细胞中,试图模拟正常肠道中肠上皮细胞与细菌的相互关系,再加入副溶血弧菌感染细胞以探究脆弱拟杆菌是否有保护LoVo细胞的作用。在此,我们选用了实时细胞分析技术(Real-Time Cell Analysis,RTCA)及显微镜下细胞形态学观察相结合的方法来检测细菌对细胞的毒性作用。将脆弱拟杆菌与人结肠癌上皮细胞来源的LoVo细胞以及小鼠巨噬细胞来源的RAW264.7细胞共同孵育8h,通过实时细胞分析计数(RTCA)及细胞形态学观察法来检测脆弱拟杆菌对于此两种细胞的毒性,在观察期内,两种细胞RTCA的标准化细胞指数(NCI)曲线与未作任何特殊处理、仅正常培养的对照组的NCI曲线趋势一致,加入脆弱拟杆菌共同孵育8h的LoVo细胞在显微镜下的细胞形态与对照组无明显差异,加入脆弱拟杆菌共同孵育8h的RAW264.7细胞形态较对照组稍有改变,表明脆弱拟杆菌对LoVo细胞及RAW264.7细胞无明显毒性;将副溶血弧菌与人结肠癌上皮细胞来源的LoVo细胞及小鼠巨噬细胞来源的RAW264.7细胞共同孵育,两种细胞的RTCANCI曲线与对照组的NCI曲线相比,在较短时间内均有大幅度降低,且加入副溶血弧菌后两种细胞都开始变圆继而皱缩破碎,形态出现明显改变,表明副溶血弧菌对于LoVo细胞及RAW264.7细胞存在明显毒性;将脆弱拟杆菌与LoVo细胞及RAW264.7细胞共同孵育3h后再加入副溶血弧菌,两种细胞的RTCA的标准化细胞指数(NCI)曲线与对照组相比虽有明显下降,但与只加入副溶血弧菌的组别相比,提前用脆弱拟杆菌保护的两种细胞的NCI曲线下降时间延后且下降幅度减少,显微镜下观察,提前加入脆弱拟杆菌保护后再加入副溶血弧菌的两种细胞之细胞形态与对照组相比,细胞形态较差,但明显好于只加入副溶血弧菌的组别,说明提前加入脆弱拟杆菌能减轻副溶血弧菌对于LoVo细胞及RAW264.7细胞的毒性作用及损伤。第二部分 脆弱拟杆菌治疗副溶血弧菌小鼠感染模型实验1.副溶血弧菌发光株的构建质粒pXEN-luxCDABE编码的荧光素酶和底物,在O2存在的情况下能进行生物发光,为了进一步实施副溶血弧菌的动物实验,我们成功地将质粒pXEN-luxCDABE导入了副溶血弧菌构建了副溶血弧菌生物发光株。为了检测新导入的质粒是否对副溶血弧菌产生影响,我们测量了副溶血弧菌野生株及发光株的生长曲线。副溶血弧菌野生株生长迅速,培养2h即可进入对数生长期,在8h左右可进入细菌平台期,我们构建的副溶血弧菌发光株与野生株的生长曲线基本重合,说明新导入的质粒pXEN-luxCDABE并未影响副溶血弧菌的生长;将副溶血弧菌野生株和发光株分别与LoVo细胞共同孵育4h后用试剂盒检测细胞受到损伤而释放出来的乳酸脱氢酶(LDH)相对含量,结果显示,与阴性对照组相比,加入副溶血弧菌的LoVo细胞LDH释放量明显升高,说明副溶血弧菌对于LoVo细胞存在明显毒性,而副溶血弧菌发光株引起的LoVo细胞的LDH释放量与野生株间没有统计学差别;将副溶血弧菌野生株与发光株分别与LoVo细胞分别孵育,并通过RTCA技术实时监测LoVo细胞的细胞指数并绘制细胞指数曲线,结果显示加入副溶血弧菌发光株后LoVo细胞的NCI曲线呈下降态势,发光株的NCI曲线与野生株基本重合,上述两实验均表明,导入外源发光质粒pXEN-luxCDABE后对副溶血弧菌菌株的细胞毒力未产生明显影响。2.脆弱拟杆菌治疗副溶血弧菌小鼠感染实验小动物活体生物发光成像技术系统主要由CCD相机、不透光的暗箱及图像处理软件组成,将带有lux发光系统的质粒导入微生物获得能够自行发光的lux菌株,再用lux菌株感染实验动物,将实验动物麻醉后放入活体成像系统的暗箱即可开始活体成像,这样就可以在不损伤实验动物的情况下实时动态地示踪lux菌株在其体内的增殖、移位及定植过程。给雌性6周大小的Babl/c小鼠灌入副溶血弧菌发光株后,发光菌能在小鼠体内形成的发光区域,发光强度随时间延长而递减。给予副溶血弧菌发光株攻毒的小鼠在攻毒后3h及14h各一次相同菌量的脆弱拟杆菌治疗,在14h时治疗组的小鼠发光强度即弱于生理盐水对照组,至26h时,脆弱拟杆菌组的小鼠几乎都不能检测到明显的生物发光,生理盐水对照组小鼠的生物发光强度虽然也有明显的减弱,但仍能检测到明显的生物发光。以每只小鼠治疗前活体成像结果(即3h)的发光值为初始值,其后每只小鼠各个时间点的发光值均除以其3h时的发光值,得到每只小鼠各个时间点发光值与3h初始值的百分比;脆弱拟杆菌治疗组的各时间点百分比平均值均低于生理盐水对照组,且经重复测量数据的方差分析,组间显著性P=0.01,故认为脆弱拟杆菌治疗组与生理盐水对照组间存在统计学差异。将两组小鼠的粪便在副溶血弧菌选择性培养基TCBS上涂板计数,发现脆弱拟杆菌治疗组的粪便副溶血弧菌的菌量明显低于对照组。上述实验结果均提示,脆弱拟杆菌的治疗有可能缩短副溶血弧菌发光株在小鼠体内的停留时间。全文结果1.脆弱拟杆菌上清液能抑制副溶血弧菌的生长。2.副溶血弧菌对于LoVo细胞及RAW264.7细胞存在明显毒性作用,而提前加入脆弱拟杆菌能减少副溶血弧菌对于上述两种细胞的损伤作用。3.导入发光质粒pXEN-luxCDABE对副溶血弧菌的生长及细胞毒性没有明显影响。4.给予副溶血弧菌发光株感染的小鼠脆弱拟杆菌治疗,与对照组相比,能显著降低相同时间点小鼠的活体成像发光值,缩短小鼠活体成像发光时间,且脆弱拟杆菌治疗后的小鼠粪便中的副溶血弧菌含菌量明显少于对照组,提示脆弱拟杆菌的治疗可能能够缩短副溶血弧菌发光株在小鼠体内的停留时间。上述细胞及小鼠实验结果表明,脆弱拟杆菌可以减轻副溶血弧菌感染引起的细胞损伤,能够缩短副溶血弧菌感染小鼠的时间。这些都提示,本株脆弱拟杆菌无明显毒性,且其有可能在副溶血弧菌引起的肠道感染之预防和治疗发挥重要作用。