硅介导的水稻细胞壁蛋白含量变化及硅-多糖化学力测定

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植物体吸收硅酸后,大部分沉积在细胞壁表面形成无机二氧化硅,而极少部分在水稻悬浮细胞水平与细胞壁半纤维素组分共价交联形成有机硅复合物。这两种不同化学形式的硅与植物细胞壁紧密作用,必然影响细胞壁蛋白的表达以及与细胞壁多糖组分的相互作用。然而硅营养添加后对水稻悬浮细胞壁蛋白含量的影响以及二氧化硅-细胞壁多糖组分的微观作用机制知之甚少。为此,我们在加硅(+Si)和不加硅(-Si)的溶液条件下,悬浮培养了遗传背景相同的水稻细胞,借助激光共聚焦拉曼光谱初步探究了硅营养添加对细胞壁蛋白二级结构组成的影响;利用串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)相对定量蛋白质组学技术分析了细胞壁蛋白含量的变化。此外,为了模拟质外体沉积的二氧化硅与细胞壁多糖组分的相互作用,我们制备了不同尺寸的二氧化硅微球胶体探针,并在云母基底上修饰了纤维素和果胶两种细胞壁主要多糖组分,利用原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)力谱技术测量了二氧化硅与不同细胞壁多糖组分的相互作用力。该项研究得出的主要结论如下:1、硅营养的添加改变了水稻悬浮细胞壁蛋白二级结构的组成,并影响了细胞壁蛋白的含量;含量变化的细胞壁蛋白涉及多种生化功能途径。水稻悬浮细胞加硅(+Si)培养后,硅主要是以半纤维素结合的有机硅复合物形式存在。通过拉曼光谱表征发现加硅(+Si)后细胞壁蛋白二级结构组成发生了改变。进一步纯化细胞壁后用0.2M Ca Cl2、2M Li Cl和SDS共同提取加硅(+Si)和不加硅(-Si)条件下的细胞壁蛋白,借助TMT相对定量蛋白质组学技术,鉴定出276个含量变化的蛋白质。通过生物信息学筛选确定了33个典型细胞壁蛋白和98个非典型细胞壁蛋白,这其中有40个蛋白上调,91个蛋白下调;这些细胞壁蛋白分布在催化、固定、水解、氧化/还原、转移和蛋白酶活性等多种生化分子功能途径中,这其中与多糖的形成或分解、铁离子稳态、金属离子转运、α-淀粉酶活性、天冬氨酸肽酶活性等功能途径有关的细胞壁蛋白被抑制;与养分存储活性、几丁质酶活性等功能途径相关的细胞壁蛋白积累。对含量变化的典型细胞壁蛋白功能进行注释后发现其主要分布在作用于细胞壁多糖的蛋白、蛋白酶类和氧化还原酶类三种功能途径中。进一步对含量变化的细胞壁蛋白功能具体分析后发现,硅营养的添加影响众多与胁迫相关的细胞壁蛋白(如过氧化物酶、天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶类及木聚糖酶抑制剂)的含量,此外还影响了部分与细胞壁多糖代谢相关的细胞壁蛋白质(如木葡聚糖-木葡糖基转移酶类和α-淀粉酶)的含量。2、成功制备了不同尺寸的二氧化硅微球胶体探针,利用AFM测定了它们与细胞壁主要多糖组分间的作用力,发现二氧化硅与果胶具有更大的结合力。细胞壁上除含有少量的有机硅外,大部分的硅都以无机二氧化硅形式沉积在质外体细胞壁表面。我们成功地将1μm和4μm大小的二氧化硅微球修饰到原子力的探针上,通过扫描电子显微镜(SEM)和AFM检测发现二氧化硅微球胶体探针能够用于与基底作用,即可获得力-距离曲线;在新劈裂的云母基底表面上修饰了细胞壁主要多糖组分-纤维素和果胶后,对其进行了AFM成像和拉曼光谱表征。通过获取力-距离曲线测量了不同尺寸二氧化硅微球与基底之间的作用力,发现相较于云母和纤维素,二氧化硅微球与果胶具有更大的结合力,说明二氧化硅更倾向与果胶多糖进行结合。此外,对于不同尺寸的二氧化硅微球分析发现,1μm的微球与细胞壁多糖组分在单位面积上具有更大的作用力,进而推测二氧化硅在沉积过程中,较小的二氧化硅微粒优先沉积在细胞壁多糖上,之后再进行二氧化硅聚合形成更大的微球。
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