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免疫疗法作为仅次于手术、化疗和放射治疗的第四种主要肿瘤治疗方式,尤其是在近年来已经取得了巨大的进展。肿瘤免疫治疗中激活免疫反应以完全抑制局部肿瘤和远处转移的治疗效果仍然有限。因此增强免疫激活诱导有效的全身抗肿瘤免疫具有重要的临床意义。低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound,LIPUS）,作为一种新兴且安全的非侵入性物理疗法作用于脾脏具有潜在的免疫调节效应。目的本文通过探讨LIPUS辐照健康Sprague-Dawley（SD）大鼠脾脏对免疫应答的影响;并辐照健康BALB/c小鼠观察其效应是否能抵御4T-1肿瘤的侵袭;同时作用于4T-1乳腺癌小鼠脾脏,证实LIPUS可以抑制肿瘤生长和转移,阐明LIPUS激活免疫增强抗肿瘤免疫效应的机制,有望为临床抗肿瘤免疫治疗提供新的辅助治疗策略。方法1.LIPUS辐照健康SD大鼠脾脏对免疫应答的影响:（1）42只SD大鼠随机分成2组:超声组（LIPUS group,n=21）和对照组（Control group,n=21）。（2）LIPUS辐照SD大鼠脾脏后,采用酶联免疫吸附测定试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测免疫球蛋白A（immunoglobulin A,Ig A）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G,Ig G）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M,Ig M）及免疫因子白细胞介素2（interleukin-2,IL-2）、白细胞介素7（interleukin-7,IL-7）、白细胞介素10（interleukin-10,IL-10）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）和γ干扰素（interferon-gamma,IFN-γ）水平。（3）采用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）评估免疫因子在脾脏及胸腺中的表达水平。2.LIPUS在BALB/c小鼠接种4T-1前辐照脾脏对肿瘤生长与转移的效果与机制研究:（1）将20只BALB/c小鼠随机分成4组:LIPUS辐照7 d组（Pre-LIPUS7,n=5）、LIPUS辐照14 d组(Pre-LIPUS14,n=5)、LIPUS辐照21 d组(Pre-LIPUS21,n=5)和对照组（Pre-Control,n=5）。（2）LIPUS辐照后,建立4T-1乳腺癌小鼠皮下移植瘤。（3）观察各组肿瘤生长及转移情况。（4）ELISA评估血浆中免疫因子水平。（5）流式细胞术（flow cytometer,FCM）检测外周血中辅助性T细胞（helper T cell,Th）、细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTLs）比例、脾脏调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）比例及CD4+、CD8+T细胞功能激活以及肿瘤微环境中CD8+T细胞功能激活水平。3.LIPUS辐照4T-1乳腺癌小鼠脾脏抑制肿瘤生长与转移的效应与机制研究:（1）将4T-1乳腺癌小鼠随机分成4组:LIPUS辐照7 d组（LIPUS7,n=20）、LIPUS辐照14 d组(LIPUS14,n=20)、LIPUS辐照21 d组(LIPUS21,n=20)和对照组（Control,n=20）。（2）LIPUS辐照后,观察各组肿瘤生长及转移情况及100 d的生存分析监测。（3）肿瘤细胞凋亡检测及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）检测。（4）RNA-Seq（定量）转录组测序以及GO功能富集分析。（5）FCM检测外周血中Th、CTLs比例;脾脏Tregs数量、滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells,Tfh）比例及CD4+、CD8+T细胞功能激活水平;肿瘤微环境中CTLs及Tregs比例、CD8+T细胞功能激活水平。（6）ELISA评估血浆、脾脏以及肿瘤微环境中细胞因子及趋化因子水平的表达。（7）蛋白质免疫印迹（western blot,WB）检测脾脏中IFN-γ表达水平。结果1.LIPUS辐照健康SD大鼠脾脏对免疫应答的影响及相关机制:（1）LIPUS组血浆中Ig M及免疫因子IL-2、IL-7、IL-10、TNF-α水平显著升高（P均＜0.05）。（2）脾脏中IL-7、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平上调以及胸腺中IL-7、IL-10的表达增高（P均＜0.05）,明确了LIPUS对增加免疫球蛋白及免疫因子的释放从而增强免疫应答的作用。2.LIPUS在BALB/c小鼠接种4T-1前辐照脾脏对肿瘤生长与转移的效果与机制研究:（1）经LIPUS辐照21 d后再接种4T-1能显著抑制肿瘤的生长（P均＜0.05）。（2）ELISA及FCM结果显示LIPUS能显著增加外周血中Th比例及IL-2、IL-7、IFN-γ水平并降低IL-10的表达（P均＜0.05）。（3）FCM结果显示LIPUS对CD4+T细胞活化及肿瘤微环境中CD8+T细胞活化无明显效应（P均＞0.05）,但能增加脾脏CD8+T细胞激活标志物CD137+的表达（P＜0.05）。3.LIPUS辐照4T-1乳腺癌小鼠脾脏抑制肿瘤生长与转移的效应与机制研究:（1）经LIPUS辐照4T-1乳腺癌小鼠14 d及21 d后均能显著抑制肿瘤的生长（P均＜0.05）;辐照21 d后能显著抑制肿瘤远处器官转移并且延长小鼠生存时间,提高生存率（P＜0.05）,故对LIPUS辐照21 d进行深一步机制研究。（2）经肿瘤凋亡检测及PCNA检测后提示LIPUS能诱导肿瘤细胞凋亡并下调PCNA的表达从而抑制肿瘤的增殖（P均＜0.05）。（3）ELISA结果显示LIPUS能显著增加外周血中免疫因子IL-2、IL-7、IFN-γ的水平（P均＜0.05）。（4）LIPUS能显著增加脾脏中Tfh比例并降低Tregs的数量、增强CD4+、CD8+T细胞的功能激活并且显著增加免疫因子特别是IFN-γ的表达（P均＜0.05）。（5）转录组学显示LIPUS能诱导脾脏中参与T细胞增殖、趋化的正调控、T细胞受体V（D）J重组、适应性免疫反应、T细胞的活化、巨噬细胞趋化的正调控等654个基因m RNA水平上调。（6）LIPUS能显著增加肿瘤微环境中CTLs与Tregs的数量比（P＜0.05）;增加CD8+T细胞活化标志物CD137+的表达及IFN-γ的分泌（P均＜0.05）;降低免疫抑制因子IL-10的水平并增加趋化因子CXCL9及CXCL10的浓度（P均＜0.05）。结论LIPUS辐照4T-1乳腺癌小鼠脾脏可以激活免疫应答,进一步增强有效的抗肿瘤免疫,从而抑制肿瘤生长和转移。有望为临床抗肿瘤免疫治疗提供新的辅助治疗策略。