逆流色谱是一种基于液-液分配原理，无固体作为固定相支撑体的制备色谱法，在分离过程中无不可逆吸附造成的样品损失。有广泛的两相溶剂体系可供选用，通过改变溶剂系统可实现不同极性物质的分离。同时逆流色谱还具有进样量和分离量大，操作简便的优点。　　本论文设计了一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用装置，采用该联用方法可以从药材中一步获取单体化合物，制备时间短。该法将集成了提取步骤的扩张床色谱与逆流色谱结合，能够充分发挥二者的优势，可直接处理含有固体颗粒的中药提取液，将扩张床色谱用于中药的提取和第一维初步分离，所得馏分通过接口直接转移至第二维逆流色谱进行进一步纯化，制得高纯度的目标化合物。研究分为下列三部分:　　一.搭建扩张床色谱-逆流色谱联用系统，应用样品环接口连接两种色谱，采用中心切割法，截取扩张床洗脱溶液中浓度最高部分转入逆流色谱进行纯化。分别从10 g黄连、37 g丹参饮片中分离得到纯度98％的黄连碱4.6 mg，纯度96％的丹酚酸B52.9 mg，联用系统回收率分别为2.2％和7.1％。结果表明扩张床色谱-逆流色谱在线联用方法是一种简单方便，适用范围广的制备联用方法。　　二.设计了真空蒸发接口，以解决扩张床色谱-逆流色谱联用时溶剂不兼容的问题。该接口利用真空加热方法将扩张床洗脱液快速蒸发后，再以逆流色谱溶剂体系复溶后转入逆流色谱进行纯化，消除了溶剂效应的影响。研究结果表明，利用基于真空蒸发接口的联用系统可一步从10 g丹参饮片中制得纯度97％的丹酚酸B50 mg，整体回收率达34％。　　三.设计了又一种可进行二维溶剂替换的联用接口——捕集柱接口，解决了溶剂兼容性问题。捕集柱接口对扩张床洗脱液具有更好的浓缩效果，使进入逆流色谱样品溶液体积小，可提高逆流色谱的分离效率。本研究以黄连为考察对象，从2 g黄连饮片中制得纯度98％的黄连碱8.4 mg，联用系统整体回收率达20％。　　另外，对于一些具有较大极性且分配系数极小的化合物，采用普通的逆流色谱方法难以实现其分离。论文的另一部分研究了两种适用于分离极性化合物的逆流色谱方法，用以分离极性生物碱和亲水性的氨基酸，扩大了逆流色谱的应用范围。研究的具体内容分为下列两个部分:　　四.本论文提出了一种新型的pH区带精制逆流色谱法，该方法以三氟乙酸作为保留剂，氨水作为洗脱剂分离碱性化合物。其分离原理是利用碱性化合物与三氟乙酸反应形成分子后实现在两相溶剂的更好分配。将该方法结合常规pH区带精制逆流色谱，用于黄连中生物碱的分离。从200 mg的黄连粗提物中分离得到药根碱1.8 mg、表小檗碱1.7 mg、黄连碱1.9 mg、巴马汀5.0 mg和小檗碱30.9 mg。经HPLC测定，纯度分别为99％、97％、99％、97％和97％。　　五.论文最后还研究了亲水性氨基酸的络合反应逆流色谱分离方法，并探讨了络合反应逆流色谱分离的过程与机理。采用环己烷-乙酸乙酯-甲醇-DEHPA-0.1M硫酸钠水溶液(3/1/1/1/5, v/v)作为溶剂体系，氨基酸与DEHPA反应形成络合物，从而在两相溶剂体系中均有分配，达到可以分离的目的。确定实验温度5℃，溶剂体系水相pH值4.88为最佳的逆流色谱分离条件。天门冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等5种氨基酸的混合物可被一次分离，产物纯度均大于95％。