【摘 要】
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由于自然环境因素的影响以及人类频繁的生产活动,有害藻华（Harmful Algal Blooms,HABs）在世界范围内频繁发生,已成为水生态领域的一个难题。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为公认的、对人类安全的菌株,其强大的分泌表达能力受到了众多学者的关注。经研究,B.subtilis可以产生大量的、具有广泛生物活性的代谢产物,如细菌素、抗生素、蛋白酶、维生素等,在农业、医药
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由于自然环境因素的影响以及人类频繁的生产活动,有害藻华（Harmful Algal Blooms,HABs）在世界范围内频繁发生,已成为水生态领域的一个难题。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为公认的、对人类安全的菌株,其强大的分泌表达能力受到了众多学者的关注。经研究,B.subtilis可以产生大量的、具有广泛生物活性的代谢产物,如细菌素、抗生素、蛋白酶、维生素等,在农业、医药业、食品等行业都有很好的应用前景。本研究从实验室菌种保藏室中选择了20株菌株,从中筛选获得了一株具有抑藻活性的B.subtilis MMB-13,对引起藻华的优势藻株—中肋骨条藻具有良好的抑制活性,通过Sephadex LH-20柱层析、液相色谱（HPLC）分离获得抑藻活性物质,根据液质联用（LC-MS）分析鉴定其为脂肽类产物Bacillomycin D。通过研究了Bacillomycin D对中肋骨条藻生理生化的影响,利用转录组学分析中肋骨条藻在添加Bacillomycin D的条件下,藻细胞中基因表达的动态变化,从表观的生理生化层面以及分子水平上揭示Bacillomycin D的抑藻机制,希望为新型除藻剂的开发提供高效安全的先导化合物。具体研究过程如下:1.B.subtilis MMB-13的筛选与鉴定以及抑藻活性物质的分离B.subtilis MMB-13是从实验室菌种保藏室中筛选得到的。通过对菌株进行生理生化测试、16S rDNA鉴定、系统发育树的构建以及生长曲线测试,最终确定筛选菌株为B.subtilis。B.subtilis MMB-13发酵上清液对中肋骨条藻有显著的抑制效果,我们利用Sephadex LH-20柱层析、HPLC成功分离出抑藻活性物质,再通过LC-MS分析鉴定抑藻活性物质为Bacillomycin D。2.抑藻活性物质Bacillomycin D对中肋骨条藻生理生化的影响Bacillomycin D是B.subtilis中常见的脂肽类产物,我们通过添加不同浓度的Bacillomycin D,测得其在24 h时抑制中肋骨条藻的半效应浓度(EC50.24h)为24.70μg/m L。在半效应浓度下,对中肋骨条藻生长过程和细胞形态等方面的生理指标以及叶绿素a、Fv/Fm、Fv/Fo、Yield等生化指标进行测试,发现Bacillomycin D显著降低了中肋骨条藻的叶绿素a含量以及荧光参数。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）显示Bacillomycin D对中肋骨条藻细胞结构造成不可逆的破坏,引起细胞壁和细胞膜破裂,细胞中核酸、蛋白质等内容物泄露,细胞空心化严重,最终无法维持正常的生命活动而死亡。3.Bacillomycin D对中肋骨条藻的转录组学分析在Bacillomycin D的半效应浓度下,研究中肋骨条藻光合系统中关键基因的动态变化,发现光合系统中的光捕获复合体LHC、二磷酸核酮糖羧化酶Ru Bisco、铁氧还蛋白-NADP+氧化酶、中央色素蛋白P700和P680等与光合途径相关的关键酶基因均呈现上调表达。以上结果说明在应对来自Bacillomycin D的环境胁迫下,中肋骨条藻通过提高光合途径中光能吸收与有机物质转化、能量的积累、物质循环代谢等关键支路的基因表达量,来维持自身的生命活动。但是随着时间的延长,Bacillomycin D对中肋骨条藻细胞结构的持续破坏,丙酮酸磷酸二激酶、丙氨酸转氨酶、转酮酶等光合途径中的关键酶基因呈现下调表达,导致中肋骨条藻无法维持自身的生长与代谢活动而最终死亡。另外,我们氨酰-tRNA合成、氮代谢途径也进行转录组分析,研究发现在蛋白质的翻译与合成过程、氮元素的积累和循环等过程中关键酶或组织的编码基因如谷氨酰-tRNA合成酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶等也都出现不同程度的上调或下调表达,证明Bacillomycin D可能是一种多功能的藻类抑制剂,可以影响中肋骨条藻多个代谢支路。该论文有图27幅,表13个,参考文献129篇
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