子囊霉素是由吸水链霉菌产生的23元大环内酯类化合物,具有良好的抑制T细胞活性功能。目前对子囊霉素进行化学修饰,获得了多种优良的衍生物,具有广阔的市场前景。针对于子囊霉素的研究多关注于传统的诱变育种和发酵工艺优化,缺少基因工程改造该菌株的报道。由于子囊霉素的产量偏低,生产成本偏高,市场竞争力较低。本研究采用基因重组的方法构建10株基因过表达的工程菌,并优化2株工程菌的摇瓶发酵工艺,初步探索其发酵罐的发酵工艺。首先,子囊霉素基因工程菌的构建及其转化条件的优化。以AS-00菌株为出发菌株,采用PCR扩增的方法获得相应的基因片段,通过同源重组或T载体克隆的方法构建重组质粒,应用接合转移的方法将重组质粒导入出发菌株,筛选获得重组子和高产菌株。结果表明,获得过表达子囊霉素合成正调控基因（fkbN、fkbE、fkbO）的pIB139-fkbN、pIB139-fkbE和pIB139-fkbO重组质粒,过表达雷帕霉素合成正调控基因（lysC/asd/ppc、rapP）的pSETL2重组质粒和pSET152-rapP重组质粒,以及含有透明颤菌血红蛋白基因-vgb的pSET-vgb重组质粒;构建筛选获得含有上述重组质粒的6种基因工程菌（AS-01、AS-05、AS-07、AS-08、AS-09和AS-10）。另外,将实验室保藏的4种过表达雷帕霉素正调控基因（rapL/rapP和AC-rap05）的pIJELP质粒和pSETGS质粒,过表达来自天蓝色链霉菌的accA2、accBE基因的pLYWA2BE质粒和过表达来自玫瑰孢链霉菌的dptE/dptF基因的pLYWEF质粒,通过接合转移的方法整合到AS-00菌株基因组中,构建了 4种基因工程菌（AS-02、AS-04、AS-03和AS-06）。对AS-08菌株的接合转移条件进行优化,确定最佳培养基为MS,最佳供受体体积比为1:5,22h覆盖10μl安普霉素,55℃进行热击,培养基中Mg2+浓度为20mM,工艺优化后接合转移效率由最初的1.9× 10-8提高到4.2×10-6。其次,对工程菌的发酵水平测定和发酵工艺进行优化。对上述10种工程菌进行单菌落分离,获得纯化的工程菌;通过抑菌平板初步筛选和摇瓶发酵复筛,得到6 株高产工程菌,分别为 AS-01、AS-03、AS-07、AS-08、AS-09 和 AS-10,其效价均高于出发菌株AS-00,其中命名为AS-07菌株为新工程菌;命名为AS-08菌株产量最高,相对效价达300%。对单菌落分离获得的AS-07-C和AS-08-C两株菌株发酵工艺进行优化,采用单因素法优化AS-07-C和AS-08-C菌株的摇瓶发酵培养基及发酵条件。结果表明,最优碳源为糊精/麦芽糊精和甘露醇,最优氮源为酵母提取物、玉米浆干粉和大豆蛋白胨,前体为2-哌啶甲酸,无机盐离子为MgSO4·7H2O、K2HPO3·3H2O和口服磷酸镁,并添加大豆油、泡敌和CaCO3,消前pH7.0;最佳发酵条件:摇床转速250rpm,摇床温度28℃,发酵周期8d,接种量10%,种龄76h。发酵工艺优化后,AS-07-C菌株的发酵效价提高了 95%,AS-08-C菌株的发酵效价提高了 110%。最后,初步考察AS-08-C菌株的5L发酵罐发酵工艺,采用三级发酵方法,初步建立发酵罐工艺,发酵相对效价为摇瓶优化工艺的140%。