原花色素是植物类黄酮次生代谢的末端产物之一,对植物的生长和生存具有重要作用。原花色素也是影响园艺产品口感严谨度的重要因素,同时对人体具有抗衰老、抗癌变、抗动脉硬化及预防心脑血管疾病等功能。因此,果实中原花色素合成及调控机制研究已经成为植物次生代谢研究的热点。杨梅果实富含类黄酮物质,但以往杨梅果实的类黄酮物质研究主要集中在花色苷的合成调控,尚未涉及原花色素的种类、含量及合成调控研究。本文以不同品种和成熟度杨梅果实为试材,克隆了原花色素合成的结构基因MrANR和MrLAR,验证了MrANR和MrLAR的基因功能,通过比较分析“荸荠”和“水晶”杨梅的RNA-Seq数据库,筛选出了参与原花色素合成调控的MYB,bHLH和WD40转录因子的候选基因,并利用分子生物学技术研究了筛选出的MYB和bHLH转录因子的转录调控功能,以期为揭示杨梅果实原花色素合成及调控机制提供依据。研究结果分述如下:1.利用RT-PCR和RACE方法克隆得到了MrANR和MrLAR基因,并研究了MrANR和MrLAR的基因功能。结果表明,杨梅果实成熟初期MrANR基因的大量表达与果实中可溶原花色素的早期大量积累相一致;成熟后期果实中不可溶原花色素的积累与MrANR和MrLAR基因在成熟后期表达量增加有关。不同成熟阶段杨梅果实中原花色素末端单元主要是EGCG,延伸单元主要包括EGCG、EGC和C。MrANR重组酶能催化矢车菊素和飞燕草素生成相应的EC和C混合物以及EGC和GC混合物;MrLAR重组酶能催化无色花青素转变为C。MrANR基因过表达降低了烟草花中花色苷含量,提高了总原花色素、EC和C的含量;MrLAR基因过表达提高了烟草花中C的含量,但对总原花色素的含量无影响。MrANR和MrLAR转基因烟草花中花色苷含量的减少主要与NtCHI基因表达量下降有关。2.基于RNA-Seq数据库,比较研究了“荸荠”和“水晶”杨梅在不同成熟阶段类黄酮合成及调控的分子机制。结果表明,参与花色苷合成与修饰过程的基因表达变化与杨梅果实中花色苷的积累相一致;在“水晶”果实成熟过程中,LAR和ANR下调表达与可溶原花色素含量减少相一致;“荸荠”果实中LAR和ANR表达水平高于“水晶”是“荸荠”果含有更高可溶原花色素含量的重要原因。系统进化分析结果表明7个MYB转录因子,3个bHLH转录因子和3个WD40转录因子可以作为调控原花色素合成的候选转录因子,值得进一步研究。此外,qRT-PCR的结果与RNA-Seq数据相似度较高,表明RNA-Seq的结果可信。3.研究了 MrMYB9、MrMYB308和MrMYBPA1转录因子在原花色素合成中的转录调控功能。结果表明,MrMYB9、MrMYB308和MrMYBPA1在其氨基酸序列上含有R2R3重复序列以及调控原花色素合成转录因子特有的5个保守位点;在系统进化树中与其他物种调控原花色素合成的R2R3-MYB转录因子聚类于同一分支内;在烟草表皮细胞中都定位在细胞核。MrANR和MrLAR基因的启动子同时含有MYBCORE调控元件和富含AC的MYB结合顺式元件。在AtEGL3的协同表达下,MrMYB308、MrMYB9和MrMYBPA1转录因子能识别激活MrANR和MrLAR启动子以及上游类黄酮合成途径基因的启动子。MrMYB308、MrMYB9和MrMYBPA1与AtEGL3共同瞬时表达,提高了本生烟叶片中原花色素的含量。组织中MrMYB9和MrMYBPA1表达与MrANR和MrLAR表达以及可溶原花色素积累变化相一致。“荸荠”果实成熟后期MrMYB308和MrMYB9表达量高于“水晶”,这与“荸荠”果实中含有较高的MrANR表达量和可溶原花色素含量相关。在“水晶”果实成熟过程中,MrMYBPA1表达与MrANR和MrLAR表达及可溶原花色素含量变化相一致。这些结果表明MrMYB308、MrMYB9和MrMYBPA1转录因子通过激活MrANR、MrLAR以及上游类黄酮合成途径基因的启动子促进杨梅原花色素的合成,但这3个转录因子对原花色素合成调控机制因品种不同存在差异。4.研究了 MrEGL3、MrbHLH1和MrbHLH2转录因子在原花色素合成中的转录调控功能。结果表明,MrEGL3、MrbHLH1和MrbHLH2在其氨基酸序列上含有bHLH转录因子共有的与MYB互作区域,bHLH结构域和转录激活结构域;在系统进化树中与其他物种中调控原花色素合成的bHLH转录因子聚类于同一分支内;在烟草表皮细胞中都定位在细胞核。在不同组织和成熟阶段“水晶”果实中MrbHLH1表达与MrANR和MrLAR表达以及可溶原花色素积累变化相一致。“荸荠”果实成熟后期MrbHLH1表达量高于“水晶”果实,这与“荸荠”果实中含有较高的MrANR表达量和可溶原花色素含量相关。MrEGL3、MrbHLH 1和MrbHLH2均能分别与MrMYB308、MrMYB9、MrMYBPA1 和 AtTT2 发生蛋白互作。MrEGL3 或 MrbHLH1与MrMYB308、MrMYB9和MrMYBPA1协同表达均激活了MrANR、MrLAR以及上游类黄酮合成途径基因启动子,并且提高了瞬时表达烟草叶片的原花色素含量。但MrbHLH1与3个MYB协同表达对MrLAR、MrCHI、MrF3’H、MrDFR1和MrANS启动子的调控活性高于MrEGL3的协同表达;瞬时表达烟草叶片中MrbHLH1侵染区的原花色素含量也高于MrEGL3侵染区。这些结果表明MrEGL3和MrbHLH1都是MrMYB308、MrMYB9和MrMYBPA1调控杨梅原花色素合成不可或缺的协同因子,其中MrbHLH1的作用效果更显著。