猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种具有高度传染性的疾病,主要症状是妊娠母猪繁殖障碍和各年龄阶段猪呼吸道症状。近年来PRRS在世界范围内的频繁暴发,给养猪业造成了巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是该病的病原体,是一种单股正义 RNA 病毒,属于套式病毒目、动脉炎病毒属。PRRSV感染后可以抑制宿主天然免疫反应,同时延迟宿主体内的特异性中和抗体的产生。这些病毒学特点以及RNA病毒特有的易突变等特征使PRRSV成为目前养猪业中利用传统方法最难防治的病原微生物之一。研究发现,PRRSV入侵猪体内的靶细胞时依赖细胞表面三个受体分子,分别是HS,CD169和CD163。CD163是富含半胱氨酸的清道夫受体（Scavenger receptor cysteine-rich,SRCR）超级家族的成员,包含9个SRCR结构域。SRCR结构域删除和替换实验表明猪CD163的SRCR5结构域是PRRSV感染所必需的。用人CD163L1 SRCR8结构域代替猪CD163SRCR5结构域能够降低细胞对PRRSV的易感性。因此,本研究尝试通过对宿主CD163基因的编辑,制备内源CD163 SRCR5结构域被精确替换的猪,并分别在细胞和动物活体水平探究这种遗传改造是否可以阻断PRRSV对宿主的侵染。为了把猪CD163 SRCR5精确替换为人CD163L1 SRCR8,本研究针对猪CD163 exon 7设计并筛选CRISPR/Cas9 sgRNA序列,同时也构建替换exon 7的同源重组载体。在大白猪胎儿成纤维细胞上对CD163基因进行编辑,利用G418筛选阳性细胞单克隆的效率达16%。然后通过体细胞核移植技术向16头受体母猪移植了重构胚,共获得15头克隆猪。利用PCR,Sanger测序和Southern blotting等方法对克隆猪的基因型进行分析,结果显示,本研究成功获得了CD163双等位基因精确修饰的克隆猪。生化检测结果表明,CD163Mut/Mut猪和野生型猪血清中的触珠蛋白（Haptoglobin,HPT）水平和全血中的红细胞生成情况均无差异,说明内源CD163基因的改造没有对其重要功能产生影响。本研究进一步对CD163Mut/Mut猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages,PAMs）和野生型猪的PAMs进行了体外攻毒试验,所用毒株是高致病性毒株JXwn06和WUH3。结果表明,CD163Mut/Mut PAMs在攻毒后未观察到细胞病变,细胞和上清液中病毒含量也极显著低于野生型猪的PAMs（P<0.001）,说明CD163基因的改造对PRRSV具有明显的抑制作用。在4个攻毒剂量下（MOI=0.005,MOI=0.025,MOI=0.1,MOI=0.25）,CD163Mut/Mut PAMs均能显著抵抗PRRSV。为了进一步探究抗病毒机制,本研究进行了免疫荧光实验来观察病毒入侵和复制的过程。结果表明,CD163基因改造并没有影响病毒颗粒的粘附和内吞,而影响了脱衣壳和释放基因组的过程,从而抑制病毒复制。最后本研究用高致病性毒株JXA1对CD163基因编辑猪进行了活体攻毒试验。试验分CD163Mut/Mut猪组（n=4）和野生型猪组（n=6）,攻毒剂量为106.5 TCID50/头,试验周期为21天。对体温、体重和临床症状等的监测结果显示,与野生型猪相比,CD163Mut/Mut猪在攻毒后发病时间延缓,发病症状减弱。此外,CD163Mut/Mut猪血液中的带毒量虽然在7dpi之前上升,但快速下降至攻毒前水平。剖解时肺中的带毒量极显著低于野生型猪（P<0.001）。从存活时间来看,野生型组6头猪全部发病死亡,而CD163Mut/Mut猪存活率为75%,并且存活猪在处死前已恢复健康。剖解时各组织眼观病变和切片的病理变化也表明,CD163Mut/Mut猪对高致病性PRRSV具有明显的抵抗力。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统介导同源重组对猪内源CD163基因进行了精确编辑,将猪CD163 exon 7替换为人CD163L1 exon 11。体内及体外攻毒试验结果表明,CD163基因的编辑对PRRSV的复制具有明显的抑制作用,使CD163Mut/Mut猪对高致病性PRRSV具有明显的抵抗力。本研究为通过基因编辑培育抗蓝耳病猪新材料奠定了很好的基础。