选择性剪接(Alternative Splicing,AS)是转录后基因表达调控的一个重要方面,是真核生物利用有限数量的基因产生满足生命需要的众多蛋白的原因之一。几乎超过95%以上的基因都经历选择性剪接,尤其是在神经系统更为常见。选择性剪接是一个复杂的动态过程,其调控机制更是涉及到多水平、多因素的综合作用。探究具有重要生物学意义的基因的选择性剪接及调控,有望为疾病预防和治疗提供新的视角。Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶SIRT1在代谢、衰老、长寿、应激反应甚至癌症等过程具有重要作用,已成为年龄相关性疾病的治疗靶点。近来发现,SIRT1pre-mRNA存在选择性剪接,其选择性剪接变异体SIRT1-△E xon8(缺失第八外显子的SIRT1)由于缺失了一段具有去乙酰化酶功能的序列,而与SIRT1全长(SIRT1-FL)具有不同的生物学功能。例如RNA/蛋白质的稳定性,蛋白和蛋白间相互作用和去乙酰化酶活性等方面二者具有明显差异。因此调控SIRTl选择性剪接模式,通过影响SIRT1-△Exon8的产生即改变SIRT1-FL与SIRT1-△Exon8的比例,可能会引起一系列生物效应的改变,甚至导致疾病。然而,目前SIRT1选择性剪接的机制尚未明了。基于对NCBI中SIRT1基因序列分析,我们发现,在SIRT1第8外显子周围存在很多AT/T富集序列,这些可能是某些经典的RNA结合蛋白(RBP)的潜在结合位点。RBP是一类调控基因转录和转录后表达的重要蛋白质。在哺乳动物细胞,前体mRNA的剪接连同mRNA代谢的几乎其他各个方面一样,在很大程度上受RNA结合蛋白调控。RBP能够直接与mRNA相互作用形成mRNA-蛋白复合物,进一步影响蛋白质的表达模式,从而调节细胞的分化、存活、衰老和对应激反应等过程。Hu蛋白家族和TIA蛋白家族是目前备受关注的两类RBPs。他们几乎参与RNA加工的全部过程,即pre-mRNA从转录直至翻译成蛋白都受Hu和TIA的调控。近年来,Hu和TIA(T-cell-restricted intracellular antigen)蛋白调节RNA选择性剪接的作用越来越受到人们的关注。研究发现,Hu蛋白能够通过抑制U2AF(U2核糖核蛋白小体辅助因子)与上游3’剪接位点的结合或抑制U1、U6snRNP(小核糖核蛋白)与下游5’剪接位点的结合,抑或通过抑制HDAC2的活性促进局部RNAP Ⅱ转录延伸速率等机制调控靶mRNA的选择性剪接,促进可剪接外显子的切除。而TIA蛋白往往与Hu竞争结合同一靶mRNA上的同一位点,通过促进U1、U6snRNP与下游5’剪接位点的结合从而将可变外显子保留下来,拮抗Hu的作用,共同调节靶mRNA的选择性剪接。由此,我们推测,Hu和TIA可能通过结合于SIRT1pre-mRNA外显子8附近的AU/U富集区调节SIRT1的选择性剪接。为了验证这一假设,我们选择了Hu蛋白家族中广泛表达的HuR和TIA家族的两个成员TIA1和TIAL1,分别构建HuR、TIA1、TIAL1过表达或干扰质粒,在293T和U251两种细胞株观察改变HuR或TIA1/TIAL1后对SIRT1第8外显子选择性剪接的影响。并利用HuR或TIA1/TIAL1与SIRT1小基因(只含有SIRT1外显子7、8、9和其间内含子的SIRT1minigene)共转染,来确证它们对SIRT1选择性剪接的调控作用。之后,探讨了HuR或TIA1/TIAL1调控SIRT1第8外显子选择性剪接的表观机制。并借助紫外损伤和NMDA损伤两种模型,观察HuR和TIA1/TIAL1在损伤情况下对SIRT1外显子8选择性剪接的调控,进一步观察这一调控作用对细胞凋亡或细胞毒性的影响。结果发现,HuR和TIA1/TIAL1能够调控SIRT1的选择性剪接,HuR通过影响SIRT1外显子8周围组蛋白的乙酰化(乙酰化增加)或甲基化(甲基化降低)修饰,从而加快RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)的延伸速率,促进外显子8的切除。相反,TIA1/TIAL1通过对该外显子周围组蛋白修饰的反向调控(乙酰化减低,甲基化增加),减慢RNAPⅡ的延伸速率,促进SIRT1外显子8的保留。并进一步证实这种调控能够在损伤情况下调节细胞功能。本研究包括四部分工作：第一部分HuR和TIA1/TIAL1参与调节SIRT1pre-mRNA选择性剪接目的1.在293T或U251细胞过表达或干扰HuR或TIA1/TIAL1;2.观察HuR或TIA1/TIAL1对内源性SIRT1外显子8和外源性SIRT1小基因第8外显子选择性剪接的影响。方法1.利用酶切、连接方法构建HuR或TIA1/TIAL1过表达或干扰质粒,使用Attractene质粒转染技术将HuR或TIA1/TIAL1质粒转染入293T或U251细胞株,设立空白对照组和实验组,借助PCR、qRT-PCR法检测293T和U251细胞中SIRT1-FL和SIRT1-AExon8mRNA的水平。2.构建只含有SIRT1第7、8、9外显子和其间内含子(内含子7、8)的SIRT1小基因质粒,并分别与HuR、TIA1、TIAL1的过表达质粒共转染进293T细胞,提取总RNA,设计针对小基因的特异性反转录引物,将小基因RNA反转录为cDNA,再利用以上设计的SIRT1-FL和SIRT1-△Exon8的引物做PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳分析小基因较长亚型SIRT1mini-FL(含有SIRT1第7、8、9外显子)和较短亚型SIRT1mini-△Exon8(只含有SIRT1第7和第9外显子)的mRNA水平。剪接产物条带利用Image J软件分析,计算短亚型SIRT1mini-△Exon8占较长亚型SIRT1mini-FL与这个短亚型SIRTlmini-△Exon8,总和的比值,即为SIRT1小基因pre-mRNA外显子8切除的百分比。结果1.成功构建了HuR或TIA1/TIAL1的过表达和shRNA干扰质粒,在293T和U251两种细胞系均成功过表达或干扰了HuR或TIA1/TIALl,并筛选出HuR-shRNA①为对HuR干扰效率最高的质粒。2.在293T和U251细胞中,过表达HuR能使内源性SIRT1-△Exon8水平增加,干扰HuR则SIRT1-△Exon8水平降低；而在TIA1或TIAL1单独干扰时,对SIRTl-FL和SIRT1-△Exon8的影响不大,两者同时干扰则使内源性SIRT1-△Exon8显著增高。3.HuR过表达能够明显增加外源性SIRT1小基因外显子8的切除,而TIA1/TIAL1的过表达则使该外显子保留。小结1.HuR和TIA1/TIALl能够影响内源性SIRT1或外源性小基因第8外显子的选择性剪接；2.HuR促进SIRT1外显子8的切除,增加SIRT1-△Exon8的水平,而TIA1/TIAL1促进该外显子的保留,使SIRT1-△Exon8的水平降低。第二部分HuR和TIA1/TIAL1调节SIRTl pre-mRNA选择性剪接的表观机制目的1.观察HuR和TIA1/TIAL1与SIRT1第8外显子周围RNAPⅡ延伸速率的关系；2.观察HuR和TIA1/TIAL1对SIRT1第8外显子周围组蛋白的修饰(H3、H4、H3K9的乙酰化,H3K9、H3K27、H3K36三甲基化)的影响。方法使用质粒转染技术控制HuR和TIA1/TIAL1的水平：1.检测RNAP Ⅱ延伸速率,采用两种方法：1)ChIP法：使用针对RNAP Ⅱ大亚基羧基末端结构域(CTD)丝氨酸-2磷酸化的特异性抗体(抗H5),利用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测磷酸化的RNAP Ⅱ在SIRT1的分布情况来反映转录延伸速率；2)D/P值法：检测并计算SIRTl远端(D,我们选择外显子9附近设计引物,)与近端(P,我们选择外显子1附近设计引物,)新生pre-mRNA产物的比值反映RNAP Ⅱ延伸速率。2.利用ChIP方法检测SIRT1启动子区域及各外显子周围H3、H4、H3K9的乙酰化,H3K9、H3K27、H3K36三甲基化水平。结果1.磷酸化的RNAP Ⅱ在HuR过表达或TIA1/TIAL1干扰时,于SIRT1外显子8周围聚集减少,在干扰HuR或过表达TLA1/TLAL1时则增多；2.D/P值间接反应RNAPⅡ延伸速率的指标,在HuR过表达或TIA1/TIAL1干扰时增大,干扰HuR或过表达IA1/TAL1时则减小；3.HuR的过表达能够影响SIRT1外显子8周围组蛋白的修饰情况：导致该区域H3、H4与H3K9的乙酰化水平明显增高,H3K9、H3K27、H3K36三甲基化程度降低。相反,当TIA1/TIAL1过表达时,SIRT1外显子8周围H3、H4与H3K9的乙酰化水平降低,H3K9、H3K27、H3K36的三甲基化程度增高。小结1.HuR和TIA1/TIAL1能够通过影响SIRT1外显子8周围组蛋白的修饰情况改变该区域RNAPⅡ的延伸速录,调控SIRT1pre-mRNA的选择性剪接；2.HuR能使外显子8周围的H3、H4、H3K9的乙酰化水平明显增高,H3K9、H3K27、H3K36三甲基化程度降低,从而加快局部RNAPⅡ的延伸速率,促使外显子8被切除；3.TIA1/TIAL1使外显子8周围的H3、H4、H3K9的乙酰化水平明显降低,H3K9、H3K27、H3K36的三甲基化程度增高,从而减慢局部RNAPⅡ的延伸速率,促使外显子8保留。第三部分HuR和TIA1/TIAL1在损伤条件下参与调节SIRT1pre-mRNA的选择性剪接目的在NMDA和紫外损伤条件下,观察HuR和TIA1/TIAL1对SIRT1pre-mRNA选择性剪接的调控作用。方法1.建立紫外损伤及NMDA模型,使用qRT-PCR法检测293T细胞中HuR、TIA1或TIAL1mRNA的水平；2.采用质粒转染技术过表达或干扰HuR或TIA1/TIAL1,并建立紫外及NMDA损伤模型,使用qRT-PCR法检测293T细胞中SIRT1-FL和SIRT1-△Exon8的(?)RNA的水平。结果1.在NMDA和紫外损伤条件下,HuR mRNA水平增高,TIA1/TIAL1mlRNA水平下降。2.在两种损伤模型中,HuR的过表达或TIA1/TIAL1的干扰能够使SIRT1外显子8切除增多,SIRT1-△Exon8mRNA水平增高；而HuR干扰或TIA1/TIAL1过表达则使SIRT1外显子8保留,SIRT1-△Exon8水平降低。小结1.HuR和TIA1/TIAL1在损伤条件下仍能够调控SIRT1pre-mRNA外显子8的选择性剪接。2.HuR促进SIRT1外显子8的切除,形成SIRT1-△Exon8增多；TIA1/TIAL1促进该外显子保留,而使SIRT1-△Exon8减少。第四部分HuR和TIA1/TIAL1在紫外损伤条件下通过调控SIRT1pre-mRNA的选择性剪接影响细胞功能目的在紫外损伤条件下,观察HuR和TIA1/TIAL1对SIRT1pre-mRNA选择性剪接的调控及对细胞功能的影响。方法采用质粒转染技术过表达或干扰HuR或TIA1/TIAL1,建立紫外损伤模型,使用CCK-8分析、LDH分析、Calcein-AM/PI检测细胞毒性,Annexin V-APC/7-ADD凋亡检测、Caspase-3活性分析法检测细胞凋亡。结果1.HuR过表达或TIA1/TIAL1干扰后细胞在紫外损伤时毒性增加,细胞活力下降,存活细胞减少。而HuR的干扰或TIA1/TIAL1的过表达对细胞毒性的影响不大。这种改变可能与HuR或TIA1/TIAL1的过表达或干扰影响了SIRT1前体mRNA选择性剪接而使SIRT1-△Exon8改变有关。2.过表达或干扰HuR或TIA1/TIAL1对细胞凋亡过程的影响区别不大。这提示,一方面,SIRT1-△Exon8对细胞内有关细胞凋亡的调节机制远比想象的复杂；另一方面,SIRT1-△Exon8对凋亡的调节可能与HuR或TIA1/TIAL1对凋亡调节不同,从而产生相互影响。小结在紫外损伤条件下,HuR和TIA1/TIAL1能够通过调控SIRT1基因外显子8的选择性剪接影响细胞功能,随着SIRT1-△Exon8比例的增加,SIRT1具有的保护作用减弱,可能使损伤加重。结论1.HuR和TIA1/TIAL1调控SIRT1pre-mRNA的选择性剪接,产生SIRT1-FL和SIRT1-△Exon8两种变异体；2.HuR和TIA1/TIAL1能够通过影响SLRT1外显子8附近组蛋白的乙酰化或甲基化修饰,加快或减慢RNAP Ⅱ的延伸速率,从而促进或抑制外显子8的切除。3.在损伤条件下HuR和TIA1/TIAL1参与调节SIRT1的选择性剪接,并且这种调节能够影响细胞的功能状态,如产生以SIRT1-FL为主的产物时,细胞将免受(或少受)损伤；但在SIRT1-△Exon8比例增加时,将会产生较重的损伤。4.由于SIRT1具有重要的神经保护作用,SIRT1pre-mRNA通过选择性剪接产生的不同的亚型具有不同的生物效应,因此探讨SIRT1选择性剪接的机制,阻止(或减少)SIRT1-△Exon8的产生,将有可能成为疾病防治的新思路。