作为第二信使,Ca2+介导植物对外界信号的应激反应,并参与细胞内多种生理生化调节过程。Ca2+依赖蛋白激酶(CPKs或CDPKs)是植物有别于动物所特有的一类Ca2+结合蛋白,参与植物生长发育,病原菌防御和非生物环境胁迫等调节过程,是植物细胞钙离子信号级联反应中的重要成员。CPKs是一个多基因家族,全基因组数据分析显示,在水稻中该家族存在31个成员,其中大部分基因功能还处未知状态。表达谱数据以及己鉴定的OsCPKs基因功能显示,OsCPKs在植物生长发育和逆境应答过程中扮演着十分重要的角色,因此,分离水稻生长发育和抗逆相关的OsCPKs基因并鉴定其生物学功能对于改良水稻重要农艺性状以及抗逆性具有重要意义,同时也为培育绿色超级水稻提供潜在的基因资源。本研究基于OsCPKs家族基因在逆境胁迫和激素处理下的表达数据,从中挑选7个受激素或逆境诱导表达的候选基因,经表达验证之后,利用过表达、RNAi干涉和突变体材料相结合的方式进行功能研究。根据过表达转基因植株的性状以及逆境胁迫下的表型筛选结果,最终将研究重心聚焦在OsCPK24和OsCPK12两个基因上,并从基因表达、蛋白定位、生化特性、底物甄选等多个方面对这两个基因进行了深入研究。主要研究结果如下:1.OsCPK24是一个有功能的蛋白激酶。在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白CPK24-HIS,经体外磷酸化实验证明OsCPK24具有自磷酸化和底物磷酸化活性。激酶活性分析表明OsCPK24激酶活性受Mg2+诱导。有意思的是,我们发现Ca2+竞争性抑制OsCPK24激酶活性,这与之前认识的Ca2+诱导CPKs活化的理论完全相反。正常生理条件下,水稻胞质内Ca2+浓度很低,而Mg2+浓度较高,这暗示OsCPK24在水稻体内以功能形式存在,而环境引起的Ca2+流信号对其功能起抑制作用。2.OsCPK24在水稻中的表达模式和亚细胞定位。RT-PCR检测结果显示,OsCPK24在根、叶、叶鞘、茎杆和穗中都表达。克隆OsCPK24上游1949-bp启动子序列融合GUS报告基因,并转化日本晴。GUS染色结果显示,转基因材料除了雄蕊之外,根、茎、叶、叶鞘、颖壳、成熟种子中都可以被染上蓝色,与RT-PCR检测结果一致。尽管OsCPK24启动子区域含有多种激素和非生物逆境响应顺式元件,但其表达仅特异地受冷胁迫诱导上调,暗示OsCPK24参与冷胁迫信号转导。为分析蛋白定位,我们构建了OsCPK24 cDNA融合报告基因EGFP载体。将构建好的载体分别通过PEG法和农杆菌侵染法瞬时转化水稻原生质体和烟草表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察到,CPK24::EGFP融合蛋白主要定位于细胞质中。3.OsCPK24基因生物学功能。为了研究OsCPK24可能参与的生物学功能,我们构建了其过表达载体pC1300s-CPK24和抑制表达载体Ds1301-CPK24,并转化到水稻品种日本晴中。根据拷贝数和表达量检测结果,一些转基因家系被挑选进行后续分析。表型考察数据显示,与野生型相比,OsCPK24过表达植株生长受到抑制,耐冷性提高,而抑制植株尽管生长没有受到明显的影响,但耐冷性降低。与野生型相比,OsCPK24过表达植株体内谷胱甘肽和脯氨酸含量升高;而抑制表达植株体内谷胱甘肽和脯氨酸含量降低。转录调控水平分析表明,OsCPK24正向调节谷胱甘肽还原酶(OsGR10-1和OsGR10-2),以及脯氨酸合酶(OsPC5S-1和OsPC5S-2)基因的表达。这些结果表明,OsCPK24通过控制氧化还原反应和渗透作用,参与水稻耐冷性调节。4.OsCPK24与谷氧还蛋白OsGrx10互作。将OsCPK24蛋白根据其结构域截短成不同长度,再与GAL4 DNA-Binding结构域融合。通过酵母双杂交实验筛选到一个小分子氧化还原蛋白OsGrx10与其激酶结构域特异互作。双分子荧光互补实验证明了这两个全长蛋白在烟草表皮细胞中可以互作。纯化Grx10-GST融合蛋白,体外磷酸化实验证明OsGrx10是OsCPK24的磷酸化底物。体外酶活实验表明,OsGrx10具有谷胱甘肽依赖的氧化还原酶功能,磷酸化修饰后其氧化还原功能受到抑制。进一步研究显示,OsGrx10表达不受低温诱导,也不受OsCPK24基因调控,其过表达对水稻的耐冷性没有明显影响。这些结果表明,OsGrx10可能是OsCPK24下游信号受体或传递体,可能其表达水平对水稻耐冷性调节不重要。5.OsCPK12基因特征。与OsCPK24—样,OsCPK12是一个有功能的蛋白激酶,它的激酶活性同样受Mg2+诱导,而被Ca2+竞争性抑制。OsCPK12是一个组织特异性表达基因。启动子表达分析和RNA原位杂交结果揭示OsCPK12主要在分生组织和微管组织中表达。在激素GA和BR处理下其转录水平升高。在水稻原生质体,BY2细胞系和烟草表皮细胞中表达CPK12::EGFP融合蛋白,结果表明OsCPK12蛋白主要定位于细胞质膜上。6.OsCPK12基因生物学功能。OsCPK12过表达转基因植株株高增高,各节间伸长,而突变体和转基因干涉阳性植株株高变矮,各节间变短。对OsCPK12过表达材料进行基因表达分析,显示细胞周期相关基因CYCB-2,CYC1A2M,MCMB-1的表达上升。7.HADS是OsCPK12的磷酸化底物。通过酵母双杂交实验,筛选到3个与OsCPK12互作的候选基因,对其中一个候选基因HADS进行了深入互作分析。HADS与OsCPK12全长蛋白互作,而不能与激酶区域互作,其序列上的Thr208位点在二者互作关系上起到关键作用。体外磷酸化实验证明,HADS可以被OsCPK12磷酸化修饰。这些结果表明,HADS是OsCPK12潜在的磷酸化底物。