耐辐射奇球菌pprM基因缺失对其类胡萝卜素合成及抗逆能力的影响

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背景耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是一种橘红色的非致病菌,因其强大的辐射抗性闻名于世。PprM是一个应激响应蛋白,能协助DR抗击辐射的能力。Deinoxanthin是存在于奇球菌属中的一种类胡萝卜素,与DR菌的颜色表型息息相关。本实验室前期将ppr M基因敲除并获得pprM基因敲除株DR-Δppr M,在研究过程中发现pprM基因敲除株的颜色淡于野生株。目的研究pprM基因的缺失对耐辐射奇球菌抗氧化及干燥能力是否有影响。验证ppr M是否会影响细胞内抗氧化酶类的活性。探究ppr M是否影响耐辐射奇球菌中类胡萝卜素deinoxanthin的合成。研究pprM是否对细胞内Mn、Fe含量有影响。探究pprM是否从转录水平上调节相关基因的表达,进一步阐述pprM基因在耐辐射奇球菌抗逆机制中发挥的作用。方法(1)将耐辐射奇球菌野生株与pprM基因敲除株用不同浓度的H2O2及同等条件的干燥环境处理,比较它们的生长情况。(2)应用化学荧光法检测两菌株细胞内活性氧自由基(ROS)含量。(3)提取两菌株蛋白,检测其过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力。(4)分别提取耐辐射奇球菌野生株与pprM基因敲除株类胡萝卜素,运用分光光度计检测吸光度值,并通过LC-MS比较两菌株中deinoxanthin相对含量的差异。(5)运用QRT-PCR探究pprM基因缺失对类胡萝卜素合成基因及dps蛋白合成基因转录水平表达的影响。(6)应用ICP-MS技术检测耐辐射奇球菌野生株与pprM基因敲除株细胞内Mn、Fe含量及Mn/Fe比率的差异。结果(1)pprM基因敲除株表现出比野生株对不同浓度的H2O2的冲击更敏感;(2)pprM基因的缺失导致细菌清除ROS的能力下降且抵抗干燥的能力减弱;(3)pprM基因敲除株过氧化氢酶的活力下降但超氧化物歧化酶活力没有大的区别。(4)pprM基因的缺失影响类胡萝卜素deinoxanthin的合成。(5)QRT-PCR结果显示pprM基因的缺失导致deinoxanthin合成相关基因及dps蛋白合成基因表达受到抑制。(6)ICP-MS结果显示pprM基因敲除株细胞内锰离子浓度下降而铁离子浓度上升,从而导致Mn/Fe比率下降。结论1、pprM基因的缺失导致耐辐射奇球菌抗氧化及抗干燥能力下降;2、pprM会影响DR菌中类胡萝卜素deinoxanthin的合成,并下调deinoxanthin合成相关基因转录水平表达;3、pprM基因的缺失导致细胞内Mn/Fe浓度比率下降。
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