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目的:运用组织块贴壁法从脊柱内镜微创手术摘除的退变椎间盘髓核组织中高效分离培养间充质干细胞样细胞,并从细胞形态、细胞表型、增殖能力、三系分化潜能、多能性基因和髓核细胞标志基因表达等方面对从不同个体退变椎间盘髓核组织样本来源的髓核干细胞(nucleus pulposus derived stem cells,NPSCs)进行深入研究。方法:组织块贴壁法高效分离人退变椎间盘髓核组织来源干细胞。将获得的细胞通过传代进行纯化和扩增培养,进行形态学观察,取第2代生长良好的干细胞,流式细胞术检测NPSCs表面标志物的表达情况,并进行成骨成脂分化潜能鉴定及成软骨分化潜能鉴定。分别取生长良好的第2代的不同个体退变椎间盘髓核组织来源的干细胞,利用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物、髓核细胞表面标志物CD24的表达,以及细胞周期和细胞凋亡情况。利用CCK8试剂盒(Cell Counting Kit,CCK-8)检测比较细胞活力,细胞计数法检测比较细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线。qRT-PCR检测比较髓核细胞相关标志基因COL2A1、Aggrecan和SOX9,髓核干细胞标志基因Tie2,以及多能性基因NANOG和OCT4的表达水平。茜素红S染色法鉴定比较成骨分化潜能,油红O染色法鉴定比较成脂分化潜能。阿利新蓝染色法鉴定比较成软骨分化潜能。使用Image J软件计算向成骨成脂成软骨诱导分化后茜素红S、油红O和阿利新蓝染色定量分析。结果:组织块贴壁法分离的NPSCs,形态多为典型梭形细胞,少数为多边形或圆形;流式细胞术检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105呈阳性表达,细胞表面标志物CD11b、CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达;经过21天的成骨成脂成软诱导分化后,茜素红染色、阿利新蓝染色及油红O染色均呈阳性,说明NPSCs具有向成骨、成软骨和成脂肪诱导分化的能力。进一步对不同个体退变椎间盘髓核组织来源的干细胞比较研究发现,根据MSC特异性表面标志物的表达水平可分为两组:MSC表面标志物高表达组(H-NPSCs)和MSC表面标志物低表达组(L-NPSCs),流式细胞术检测结果显示CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面标志物表达率均大于95%,与之相应的是其传代后的细胞形态均一,呈成纤维细胞样的长梭形。而L-NPSCs的MSC特异性表面标志物CD29和CD105表达率显著低于H-NPSCs,CD29的表达率为36.52±0.14%,CD105的表达率为46.58±0.15%,细胞形态表现多样性,除典型梭形细胞外,可见多边形或圆形出现。两组都不表达CD11b、CD14、CD24、CD34、CD45和HLA-DR(表达率低于1%)。CCK8检测的细胞活性和细胞周期结果表明:与L-NPSCs相比,H-NPSCs具有更强的增殖能力。与细胞周期结果分析一致,L-NPSCs中G0/G1和G2/M期停滞增加,S期的进入量低于H-NPSCs,细胞凋亡、细胞倍增时间结果分析表明H-NPSCs的凋亡率和倍增时间都要低于L-NPSCs。qRT-PCR检测这三种细胞髓核细胞标志基因COL2A1、Aggrecan、SOX9的表达情况显示:L-NPSCs的三种标志基因的表达量都显著高于H-NPSCs的表达量。髓核干细胞标志基因Tie2的表达情况显示:H-NPSCs的表达量的显著高于L-NPSCs的表达量。而多能性基因NANOG和OCT4的表达情况显示:L-NPSCs的表达量显著高于H-NPSCs的表达量。诱导分化后特异性染色检测显示,L-NPSCs的多向分化能力明显弱于H-NPSCs。结论:1.组织块贴壁法可从人退变椎间盘髓核组织中分离出间充质干细胞样细胞,表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达造血干细胞表面标志物CD11b、CD14、CD34、CD45和HLA-DR,并具有向成骨成脂及成软骨多向分化潜能。2.退变椎间盘髓核组织来源的NPSCs可根据其间充质干细胞表面标志物的表达水平分为高表达组(H-NPSCs)与低表达组(L-NPSCs)。与H-NPSCs相比,L-NPSCs的增殖能力、细胞活力和多向分化潜能明显减弱,而L-NPSCs的髓核细胞标志基因表达水平显著高于H-NPSCs。髓核干细胞的MSC表面标志物的表达水平与细胞增殖能力、多向分化潜能和髓核细胞特异性标志基因表达水平相关。