论文部分内容阅读
[目的]
研究人参皂苷Rg1（ginsennoside Rg1）保护大鼠骨髓间充质干细胞(rat bonemarrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)抵抗低氧-无血清处理诱导的细胞凋亡及其相关机制。
[方法]
用MTT法测定细胞增殖率，培养液中加入不同浓度的Rg1（0.1μg/l、0.5μg/l、1μg/l、5μg/l、10μg/l、50μg/l、100μg/l、500μg/l和1000μg/l）的方法筛选Rg1促细胞增殖的有效浓度。测定rBMSCs生长7天的生长曲线及Rg1的影响。无血清培养基置1％O2、5％CO2三气培养箱中预平衡24h。rBMSCs更换低氧预平衡的无血清培养基后置1％O2、5％CO2三气培养箱中培养24h，复制低氧/无血清培养诱导细胞凋亡实验模型。Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术检测细胞凋亡率。罗丹明123和Hochest33258染色，荧光显微镜下观察拍照，检测线粒体膜电位。比色法检测Caspase-3活性。qRT-PCR检测细胞HIF-1α、Bcl-2、Bcl-xl、Bad、Bax、Rho-A、ROCK-1、ROCK-2等目标基因的mRNA表达。Westemb1ot检测HIF-1α、RhoA、ROCK-1、ROCK-2、MLC-2、Bcl-2、Bcl-xl、Bad、Bax等目标蛋白的表达。si-RNA ROCK-1转染rBMSCs，用RT-PCR和Western blot二种方法，从mRNA和蛋白表达水平鉴定ROCK-1的敲除效率。
[结果]
1.人参皂苷Rg1抑制低氧-无血清培养诱导的rBMSCs凋亡。
10μg/l、50μg/l、100μg/l、500μg/l有明显的促细胞增殖效应。rBMSCs经低氧-无血清培养24h后，低氧-无血清(C2)组的凋亡率为常氧对照组(C1)为3.24倍(P＜0.01);罗丹明123染色后黄绿色荧光增强，表示线粒体膜电位下降;Caspase-3酶活性升高5.17倍;促凋亡基因Bad和Bax的mRNA表达分别增加1.16倍和0.5倍，P＜0.01和P＜0.05;蛋白表达分别增加1.98倍和1.6倍(均P＜0.05)。低氧-无血清+Rg1低、中、高（Rg1-L、M和H）浓度组相比C2组凋亡率均降低，线粒体膜电位升高，Caspase-3酶活性降低，Bad和Bax的mRNA表达和蛋白表达均降低(P＜0.05或P＜0.01);抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达和蛋白表达在C1组、C2组和Rg1-L组组间比较无明显差异，而Rg1-M和H组Bcl-2 mRNA和蛋白表达均升高(P＜0.05)。Bcl-xl mRNA表达和蛋白表达组间比较无统计学意义。
2.人参皂苷Rg1抑制ROCK-1 mRNA和蛋白表达以及ROCK-1基因敲除下调促凋亡基因的表达，上调抑凋亡基因的表达。
同C1组相比较，C2组p-RhoA蛋白表达升高1.64倍(P＜0.05); ROCK-1的mRNA表达增加2.33倍，蛋白表达增加了1.92倍(P＜0.05和P＜0.01);MLC-2蛋白表达增加1.71倍(P＜0.05)。Rg1各浓度组与C2组比较，pRhoA蛋白表达无明显差异;ROCK-1 mRNA和蛋白表达明显下降(P＜0.01); MLC蛋白表达下降(P＜0.05);ROCK-2的mRNA表达和蛋白表达组间比较均无统计学意义。
经低氧-无血清处理的siROCK-1转染组Bad mRNA表达较阴性转染组降低73.2％(P＜0.01)，蛋白表达降低53.5％(P＜0.01);Bax mRNA表达降低71.4％(P＜0.01)，蛋白表达降低47.2％(P＜0.05)。Rg1 siROCK-1各浓度组的反应同单纯si-ROCK-1转染组。经低氧-无血清处理的si-ROCK-1转染组Bcl-2 mRNA表达较阴性转染组升高2.62倍(P＜0.01)，蛋白表达升高2.11倍(P＜0.05); Rg1siROCK-1各浓度组的反应同单纯si-ROCK-1转染组。Bcl-xl mRNA和蛋白表达组间比较无统计学意义。
3.人参皂苷Rg1以及ROCK1基因敲除对HIF-1α蛋白和mRNA表达无明显影响
[结论]
在低氧-无血清培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡中，人参皂苷Rg1通过对抗细胞凋亡的线粒体途径、下调ROCK-1基因表达进而上调抗凋亡基因Bcl-2和下调促凋亡基因Bad和Bax的mRNA和蛋白表达水平，抑制细胞凋亡。