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背景:肿瘤细胞通过生长迅速、异常能量代谢和对特定蛋白的自身调节,形成和维持一个不适合正常细胞生存的细胞外酸性微环境,以保证其发生、增殖、侵袭与转移。对于酸性微环境的产生机制和其对肿瘤细胞生物活性影响的研究,可能有助于寻找出高效低毒的抗肿瘤手段,并且成为中西医结合抗肿瘤研究的新切入点。导师魏品康教授根据其长期临床经验总结,提出了胃癌痰证学说,并在此理论上创立了消痰散结方,经实验研究和临床观察证明,可有效抑制胃癌细胞生长、侵袭和转移,延长患者生存期。半夏是消痰散结方的君药,研究姜半夏对胃癌细胞酸性微环境的影响,不仅是探索消痰散结方的抗肿瘤新机理,更是对胃癌痰证学说与肿瘤酸性微环境两者的相关性的一种探讨,可能有助于阐明痰浊的物质基础。目的:从肿瘤细胞生存的酸性微环境角度出发,研究姜半夏乙醇提取物的抗肿瘤机制,并进一步丰富胃癌痰证理论。方法:1、药物与分组:将姜半夏粉碎后,经由95%乙醇提取,过滤灭菌后获得姜半夏乙醇提取物。实验时随机分为5组,其中空白对照组加入不含药物的RPMI 1640培养液培养,药物实验组分为4组,分别含姜半夏乙醇提取物的终浓度为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml。实验重复3次,合并数据进行统计。2、将SGC-7901细胞(5×104/m1)接种于3块96孔板,每块板分5组,每组设5个平行孔,另设空白调零孔,培养24、48、72小时后,使用MTT法计算各组细胞的OD值。计算姜半夏乙醇提取物72小时的IC50。3、各浓度药物组分别干预细胞72小时后,置于倒置相差显微镜下观察照相。4、各分组细胞分别培养0、12、24、36、48、60、72后,采用MTT法检测各组细胞的OD值,根据OD值绘制细胞生长曲线。5、将不同浓度药物干预细胞72小时后,采用AnnexinV- FITC/ PI双标记法流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。6、使用紫外分光光度法观察药物干预后细胞ATP酶活力,根据公式(总ATP酶活力(U/ml)=(测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(0.02umol/ml)×6×样品稀释倍数×7.8)计算各浓度药物干预细胞72 h后细胞总ATP酶活力。7、分别在药物干预细胞第0、24、48、72小时,使用BCECF-AM荧光探针检测各组细胞细胞内PH值。同时使用pH检测仪测定胞外培养基pH值。8、参考药物72小时IC50,干预细胞72小时后,采用荧光定量PCR法检测细胞V-ATP、NHE1基因的表达。结果:1、不同浓度姜半夏乙醇提取物均能不同程度地抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖;在姜半夏乙醇提取物诱导细胞后细胞发生了边缘毛刺、体积缩小等形态学变化,同时可见细胞折光度和贴壁能力下降;AnnexinV-FITC/PI双标记法检测显示姜半夏乙醇提取物可诱导细胞发生凋亡;细胞总ATP酶活力在药物干预72小时后出现明显下降;并且随着药物浓度增加细胞凋亡率、细胞形态异常改变以及药物对细胞ATP酶活力抑制作用均呈上升趋势。2、姜半夏乙醇提取物(0.5mg/ml)作用细胞72小时后,细胞V-ATP、NHE1基因荧光定量PCR检查结果分别是0.174%±0.079%,0.180%±0.165%,而对照组荧光定量PCR检查结果为0.318%±0.148%,0.652%±0.323%。两组检查经统计,P值分别为0.020和0.001,均具有统计学差异。3、使用BCECF-AM荧光探针检测可发现,姜半夏乙醇提取物可随着药物浓度的增加和干预细胞时间的延长,更明显的降低SGC7910细胞内的PH值。当干预细胞至72小时时,除0.125mg/ml浓度组外,其余各组药物浓度与对照组相比,均具有明显统计学差异(p<0.01)。同时细胞外PH值检测也发现,姜半夏乙醇提取物可提高细胞外PH值,从而使得细胞内外PH值差缩小。结论:1、姜半夏乙醇提取物可抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖,促进其凋亡,抑制细胞ATP酶活力。2、姜半夏乙醇提取物可降低SGC7901细胞内PH值,同时升高肿瘤细胞外的PH值,缩小细胞内外PH值梯度。3、姜半夏乙醇提取物对SGC7901细胞的V-ATP、NHE1基因表达有明显的抑制作用。