背景细胞疗法是目前全球医药卫生的第四大治疗支柱,其对于再生医学的发展起到至关重要的作用。再生医学的目的在于替代或再生细胞、组织以及器官以达到恢复或建立正常功能的作用。近20多年来,以细胞为基础的疗法已成功制造出多种产品用于临床治疗,然而仅局限于某些特定器官组织。毛囊作为人体内大量丰富存在的微型器官,其形态发生收到上皮成分和真皮成分的相互作用调控,进行有节律的周期变化,目前是再生医学中的热点研究领域。对于毛囊再生的探索将为其他器官系统的再生医学带来重要的参考,也有助于治疗脱发。目前体外的毛囊重建尚未成功,由于信号因子和细胞因子的丢失或减少,无法在体外模拟体内毛囊形态发生。尽管现行有一些体内毛囊重建的方案（例如小室法,注射法）,但他们各自尚有缺陷。例如注射法移植阶段的早期会出现广泛的凋亡,可能是由于血液供应不足导致移植物存活率低。此外,当使用小室法进行体内重建的时候,需要大量种子细胞实现毛囊重建。因此,我们需要进一步的研究来了解是否有更好的改善方案来提高毛囊重建的效率。总结现有的体内毛囊再生的实验研究及现有的组织工程问题可以得出结论,适宜的移植物存活的微环境必须具备（ⅰ）足够的组织存活空间,（ⅱ）移植位点充足的血供,（ⅲ）和宿主的血供系统进行充分的代谢物质交换的能力,以及（ⅳ）较低的机械压力。在以上的先决条件中,血管化是目前组织工程最关注的热点问题。传统的血管化方法作用于刺激新生血管由宿主向内生长到移植物体内。然而,这些方法面临的问题是新生微血管的平均生长速率仅为～5μm/h,因此完整的血管化需要一段很长的时间,这可能导致由于移植早期缺氧而造成的组织坏死。因而“预血管化”的概念近年来迅速发展。可以在移植前在移植位点处预置一个微血管系统,它将缩短移植物在移植早期遭受无血液供应的缺氧时间,并有助于移植物的早期阶段存活和长期功能。然而现有的预血管化手段并不能解决上述其余的阻碍移植成功的问题。近期研究利用异物反应构建的皮下预血管化包膜作为胰岛细胞移植腔给了我们新的启发。这个内腔有充足的体积供移植细胞生存,有充分的血供给细胞提供营养。然而,关于这个包膜的机械性能和是否适宜代谢物质交换并没有得到研究和讨论。此外,过多的异物反应导致的胶原堆积对组织工程结果会有负面的影响,因此适合移植物生存的异物反应的时机有待进一步研究。为了在毛囊再生中充分利用异物反应,我们需要进一步探索准确的异物放入时长,分析其生理性能和机械性能,并且研究这种方法是否适用于改善毛囊再生的效率。在本实验研究中,我们通过皮下置入医用导管建立了预血管化皮下移植腔。然后,我们在不同的时间点对该移植腔进行组织学的分析与评价,得出适宜细胞生长和移植的异物放置的可能最佳时间点,并对其机械性能进行探讨。在异物取出后,将新生鼠皮肤细胞原位植入该预调控的预血管化包膜移植腔中以观察毛发重建情况。目的（1）通过调控异物反应的时间构建预血管化胶原基质,并探究其生理学性能的波动;（2）探究该最佳预调控的预血管化胶原基质的机械性能;（3）探讨该预调控的预血管化胶原基质作为改良的移植位点是否能提高毛囊重建率;方法（1）异物反应诱导预血管化胶原基质移植腔的构建和生理性能评价将直径10 Fr,长20 mm的医用硅胶导管皮下植入成年无胸腺裸鼠的背部。在背部外侧做一个2mm的纵向横切口,使用钝性解剖分离可以在切口线下创建一个平行于鼠背部正中线的小口袋。将导管从切口送入裸鼠皮下的空间内,切口用可4-0缝线封闭。植入后,宿主血液中的粘附蛋白附着在导管上,趋化导管周渐渐形成密集的肉眼可见的血管化包膜。分别在导管置入1周、2周、3周、4周、5周后解剖法分离新生包膜,取出连带着新生血管化包膜的导管,通过光镜、扫描电镜、HE染色、Masson染色、免疫荧光、WB等评估血管化包膜移植腔的生理学性能。（2）预血管化胶原基质的机械性能评价对于流变实验,用内径为8 mm的打孔器制备圆形样品（直径8 mm,1mm厚）,所有流变学振荡实验均在TA Discovery Hybrid流变仪上进行,使用8mm直径的平行板,在25℃下实验。在振荡-频率实验中,预血管化基质和皮肤样品在0.5%的恒定应变下承受从0.1rad/s到100rad/s的剪切速率。在0.5%的恒定应变下进行0.1至100 rad/s的粘度的测量。对于拉伸试验,制备长方体样品（30mm长,1mm厚,7～10mm宽）的PVCF基质和正常皮肤,并以20mm/min的速度拉伸至万能拉伸试验机（Instron 5965）上的断裂点,计算工程应力和应变。杨氏模量通过应力-应变曲线的线性区域的斜率计算。通过循环拉伸试验和应力松弛试验测量这些样品的粘弹性特征。对于循环拉伸试验,基质样品和皮肤样品承受33.3%的拉伸应变,然后释放至0%,以20mm/min的恒定速率持续10个循环,用来计算回复的应力损失量。在基质样品上改变应变至最高66.7%进行新一次10个循环的拉伸试验,并在1小时后进行第二次重复。根据承受33.3%应变的第一个滞后回线内的面积分别基质和正常皮肤样品的能量耗散。相应的耗散率通过耗散能除以回线中上升曲线下的面积得到。对于应力松弛试验,将每个样品以20mm/min的恒定速率拉伸至66.7%应变,然后在该应变条件下维持拉伸的状态60秒。测量作为恒定应变的作用力对于弛豫时间的函数。计算每个瞬时时间的应力F（t）与应力松弛开始时的应力F（t0）之间的变化。由于该样品来自不同的材料,因此通过将其除以对应于每个样品的F（t0）来归一化该变化。（3）新生鼠皮肤细胞移植入预血管化胶原基质腔实现毛囊重建从0-2天的新生C57BL/6J小鼠皮肤中分离小鼠表皮细胞（MECs）和小鼠真皮细胞（MDCs）。简而言之,取出全层皮肤并在磷酸盐缓冲盐水中以0.1%（wt/vol）中性蛋白酶在4℃温育。在PBS中漂洗3次后,然后用镊子将皮肤分成表皮和真皮。将真皮片切碎并在0.2%胶原酶中于37℃消化1小时。将表皮片切碎,然后在0.25%（wt/vol）胰蛋白酶中于37℃温育10分钟,同时轻轻摇动。消化后,依次通过100和40μm筛网细胞过滤器过滤各组分。通过以320g离心5分钟收集细胞,并重悬浮于Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Gibco,Grand Island,NY,USA）中用于细胞移植。分别在导管置入后1周、2周、3周、4周、5周时,通过腹腔内注射10g/1戊巴比妥钠（0.4ml/100g）将裸鼠麻醉,并将镇静小鼠的移植区域用聚维酮碘清洁。在植入的导管的上边缘的近端,制作4mm的切口,切除导管上缘周围的组织基质以抽取出导管。使用移液管将细胞悬液分别移植50μL含有1×106MDC和0.5×106MECs的DMEM悬浮液到不同时间段形成的预血管化内腔中。切口用外科缝线封闭用手术缝合线封闭每个切口。使用注射法将来自对照组的动物用相同量的细胞悬浮液移植。至于移植到小鼠背侧的平坦PVCF基质上,将直径10 mm,环形边沿为2 mm的Ep管帽作为异物材料的选择,将其移植在成年裸鼠减去背部皮肤的皮下组织表面之上,选取异物反应持续3周的小鼠,制备50μL含有5×106MDC和5×106MECs的DMEM悬浮液。在镇静的小鼠背部做垂直于异物边沿的2mm切口以移除植入的平盖而不拉出周围的组织,得到平坦的预血管化的胶原基质。然后将细胞悬浮液涂抹到这些新生胶原基质上。圆形开口用相同尺寸的塑料薄膜覆盖,用4-0缝线缝合防止污染,1周后取掉薄膜。使用小室法作为对照将来自对照组的动物用相同量的细胞悬浮液移植。移植后2周取材移植部位并进行组织学分析。在处理之前,通过光学显微镜观察不同组移植部位生长的所有毛发,拍照,使用镊子剥离,并涂布在纸上进行毛发计数。将收获的移植位点组织块在10%福尔马林中固定24-48小时。石蜡包埋后,使用苏木精和伊红对切片进行染色,并进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜下观察。结果（1）异物反应诱导预血管化胶原基质移植腔的构建和生理性能评价将新生胶原基质和导管一同从裸鼠背部分离出后,体视镜下观察可见预血管化胶原基质的外表面由密集的新生血管和胶原纤维组织构成。扫面电镜下观察可见基质的内表面覆盖有交错排布的胶原纤维,形成多孔的网状结构,随着异物反应的时间增加,其形成的孔径越来越小。在3周的异物反应组中可见红细胞和血小板镶嵌在胶原纤维网络中,形态类似于血供良好的细胞外基质。将3周组的基质进行脱细胞处理,可见蜂巢样的网状结构。组织学观察可见,通过马松染色,1周时,观察到有新形成的胶原纤维和可见的新生血管。到3周时,发现交错的胶原纤维密集排列在基质的内面,伴有大量新形成的血管。到5周时,观察到高度交联的致密的胶原原纤维。通过F4/80免疫组化,巨噬细胞在1周时数量最大。通过CD31免疫荧光,血管形成在2-3周最高。WB结果也验证了这一结论,即血管形成会在3周后达到最高。（2）预血管化胶原基质的机械性能评价在流变实验中,预血管化胶原基质的粘度随着剪切频率从0.1到100rad/s的增加而稳定下降,表现出该组织的典型的剪切变稀的性质。另外,与正常皮肤组织相比,基质的粘度低得多,在高剪切速率区域下降得更快。PVCF的储能模量（G’）和损耗模量（G”）均显着低于正常皮肤组织,表现出高柔韧性和低机械性能。对于基质样品,在高剪切频率区域G’和损耗模G”之间存在交叉,其中G”高于G’,说明其具有在高剪切下向液体转化的行为,反映了高剪切速率下基质组织内部的大规模构象重排,体现了基质的可注射性能,这一性能体现了该基质在今后的微创手术,3D打印等许多应用中有很大前景。在拉伸试验中,该基质样品的拉伸强度远低于皮肤样品的拉伸强度,这与流变学结果一致,表明其高柔韧性和低机械性能。在循环拉伸试验中,基质在第一个循环内的能量耗散为6.5KJ/m3,耗散率为39.07%,是皮肤样品的1.3倍,表明基质的粘性较高。10个循环后,基质的拉伸强度恢复损失率为40.2%,在正常皮肤中为25.2%,表明基质的抗拉强度较低。应力松弛试验表明在恒定应变下该基质样品的应力更低,且在松弛的期间一直低于皮肤的应力。这表明该基质在移植期间承受相同应变时,会产生较少的应力,因此会对移植物产生较少的影响。我们可以得出结论,高度柔韧的超粘弹性预血管化基质具有适宜移植物生存的机械性能,具有较低的坚固性和机械应力。（3）新生鼠皮肤细胞移植入预血管化胶原基质腔实现毛囊重建在不同的时间点取出硅胶导管后,将新生鼠皮肤细胞置入预血管化包膜中以在体内形成毛囊重建。移植后12天,观察到浓密的黑色毛干形成在包膜之内。且计算毛囊重建数量得知,在异物反应产生2-3周时的包膜内重建的数量最高,并且远大于传统注射法产生的毛囊数量。将此种预血管化移植腔的方法施用于其他毛囊重建模型中,同样发现异物反应3周后,有毛发垂直于皮肤表面长出,与正常毛发生长方向相同,与小室法得到毛发形态一致,并且重建数量远大于小室法。在硅胶管模型的组织学检查中,改良的移植腔中新生了大小和结构发育正常的毛囊,且坏死灶数量远低于对照组注射法。此外,在异物反应3周时毛囊间血管的面积比其他时间点更高。结论（1）利用异物反应的原理产生的预血管化胶原基质有较大的体积,多孔的网状骨架结构,散在分布着大量的新生血管网。通过控制异物反应的持续时间,可以产生一个预调控的移植位点,在生理性能上模拟了体内的微环境。（2）预血管化胶原基质的机械性能相较于皮肤组织来说对移植物的生存有很大优势,它作为移植位点模拟了一种具有超级粘弹性的水凝胶,有高柔韧性,低坚固性以及持续形变下的快速应力降低能力。（3）异物反应早中期（2-3周）形成的预血管化胶原基质作为改良的移植位点可以提高移植细胞的存活率,减少凋亡坏死,提高毛囊重建的再生率。