论文部分内容阅读
血吸虫病是一种严重危害人类健康和阻碍流行区社会经济发展的寄生虫病。诊断是确定感染的有效手段,在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果,还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病防治效果和评估流行趋势等等,均需要以诊断结果作为评判依据之一。传统的病原学方法是诊断血吸虫病最为可靠和经典的途径,但费时、费力且敏感性不高,难以适应大规模现场防治的需求。免疫学诊断方法具有较高的敏感性、特异性和实用性等优点,在血吸虫病的监测、防治以及疗效考核等方面具有广泛的应用价值。诊断抗原的筛选和鉴定不仅是免疫学诊断研究的核心内容,并且是建立免疫学诊断方法的基础。本研究利用吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人血清分别筛选成虫、虫卵的cDNA表达文库,寻找可用于日本血吸虫病检测或疗效考核的潜在靶点,初步筛选获得了120个阳性克隆。结合阳性克隆的反应强度、分类和插入片段的大小,将所获的17个阳性克隆的插入片段进行测序,对其DNA序列进行生物信息学分析。根据序列分析的结果,选择了10个目的基因片段进行表达,利用生物信息学软件分析编码蛋白的性质并预测其功能。以阳性克隆SJA4-6、SJA6-5、SJE18-4、SJE20-4、SJE22-1、SJE22-4、SJE28-2和SJE28-6为模板,成功构建了10个含有目的基因的重组质粒(GST tag),重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后获得了9种融合表达的重组蛋白。其中5个重组蛋白含有可溶性表达组分,4个重组蛋白为包涵体。利用亲和层析的方法对含有重组蛋白的菌体裂解液进行纯化,获得了4种纯度较高的重组蛋白,分别为rSjP1、rSjP2、rSjWSC1P和rSjEFCAB。采用免疫学方法初步评估了所获重组蛋白的免疫诊断价值,以rSjP1、rSjWSC1P和rSjEFCAB为包被抗原的间接ELISA方法可明显区分日本血吸虫病人混合血清和正常人混合血清,病人血清反应的OD值(P)均达到正常人的(N)2.1倍以上,其中重组蛋白rSjEFCAB的P/N值达到3.9,表明该蛋白具有良好的应用前景。建立了以rSjWSC1P和rSjEFCAB作为包被抗原的间接ELISA方法。该方法检测日本血吸虫病人的敏感性分别为72%(36/50)、74%(37/50)；检测非流行区正常人的假阳性率为0-3.3%(0/30-1/30)；与并殖吸虫病人无交叉反应,与囊虫病人、旋毛虫病人的交叉反应率分别为10%(1/10)和11%(1/9),与华支睾吸虫病人的交叉反应率分别为0(0/5)和20%(1/5)。研究结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性,重组蛋白rSjWSC1P和rSjEFCAB是日本血吸虫病潜在的诊断抗原。同时,本研究还采用免疫沉淀反应分离血吸虫病人血清中的循环抗原,利用质谱和生物信息学软件分析循环抗原的蛋白序列,寻找高丰度的循环抗原分子。鉴于禽类与哺乳类动物的遗传距离较远,来源于禽类的抗体不易发生交叉反应,本研究制备和纯化了抗血吸虫成虫抗原的卵黄抗体(IgY),并建立了基于免疫沉淀反应(以IgY抗体做为捕捉系统)和蛋白质组学技术鉴定日本血吸虫循环抗原的方法。应用该方法从日本血吸虫病人血清中富集循环抗原,鉴定出7种蛋白组分,为循环抗原的深入研究提供了新的途径；同时为发展基于IgY和循环抗原的血吸虫病早期诊断或疗效考核方法奠定了基础。本研究为日本血吸虫病检测或疗效考核诊断抗原的筛选、鉴定以及发展相应的诊断技术提供了新的科学依据。