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研究背景创面愈合是一个动态、有序而又复杂的生理过程,包括多种细胞事件,如细胞增殖、细胞粘附、趋化反应以及细胞凋亡。皮肤全层缺损或大面积烧伤发生时,表皮、真皮、毛囊和汗腺等附属器官都被破坏,成纤维细胞(Fibroblasts,FBs)与角质形成细胞(Keratinocytes,KCs)是最重要的两种创面修复细胞,依靠KCs的增殖分化形成上皮完全覆盖伤口是创面修复最理想的结果,因此扩大角质形成细胞的来是临床治疗中亟需解决的重要问题。KCs的重编程是一种很有前景的诱导方法,但转化率低下且具有一定的安全隐患。在这项研究中,我们研究新生儿皮肤成纤维细胞(HFF-1)在常规培养中随着时间积累转分化为角质形成样细胞(Keratinocyte-like cells,KLCs)的现象,并评估了KLCs特征以及转分化过程的潜在机制。研究目的1.探究HFF-1转分化为KLCs的现象与KLCs的特征。2.探究HFF-1转分化为KLCs的机制。研究内容与方法一、HFF-1转分化为KLCs现象的发现与研究1.HFF-1在体外连续传代培养(培养基成分:高糖DMEM培养基加10%血清),当细胞密度融合至80%-90%时,在六孔板中,按照5×10~5个/孔的细胞密度进行细胞传代培养,每日镜下观察细胞密度和形态。通过流式细胞术和细胞免疫荧光分析整个转分化过程中(HFF-1、HFF-25Day、KLCs)FBs标记蛋白Vimentin和KCs的标记蛋白CK14的变化趋势。2.通过细胞分子学实验RT-q PCR、Western-Blot、划痕实验、Transwell实验和CCK-8实验研究转分化前后细标记蛋白的表达、m RNA变化水平、细胞的迁移能力和增殖能力等变化趋势。3.通过构建小鼠全层创面缺损模型并移植转化前后的细胞悬液,动态观察并记录创面愈合情况;通过HE染色评价各个时间点各组创面愈合度、皮肤结构、炎症浸润等;通过免疫组化标记角质形成细胞标记物CK5,评价各个时间点各组创面基底层角质形成细胞数量等。4.通过裸鼠成瘤实验,检测HFF-1、HFF-25 Day、KLCs三组细胞的致瘤性,并对新生肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。二、HFF-1转分化为KLCs的机制探索1.对HFF-1、HFF-25Day、KLCs和KCs转录组测序(m RNA-seq),通过对整个转分化过程趋势分析、差异性基因GO富集、KEGG富集,寻找调控转分化过程的潜在通路或靶基因。2.通过RT-q PCR、Western-blot、免疫荧光和靶向激动剂和抑制剂调控实验,验证转分化过程的具体机制。研究结果一、HFF-1在体外连续传代培养条件下能够转分化为KLCs1.HFF-1在添加10%血清的高糖DMEM培养中连续培养40天以上,不施加任何干预措施的情况下,能转分化KLCs,整个转分化过程在第25天开始进行,第40天几乎完成;流式细胞术分别评估CK14阳性细胞和波形蛋白阳性细胞比例,CK14阳性细胞百分比在第10、20、30和40天分别为19.55±0.43%、49.92±0.38%、76.63±0.64%和98.10±0.66%;波形蛋白阳性细胞百分比在第10、20、30和40天分别为72.42±0.48%,59.19±0.10%,22.41±0.33%和3.54±0.26%。免疫荧光显示KCs特异性蛋白CK14阳性细胞数量逐渐增多,FBs特异性蛋白Vimentin和α-SMA阳性细胞逐渐减少,到第40天时Vimentin或α-SMA阳性细胞明显减少,几乎不能被检测到。2.Western-blot显示上皮性标记蛋白E-Cadherin,KCs标记蛋白(CK5,CK14,CK19和Integrinβ1)只在KLCs和KCs中表达。同时,成纤维细胞标记蛋白Vimentin只HFF-1中表达。RT-PCR与Western blot结果一致。CCK8测定表明,KLCs和KCs的增殖率明显高HFF-1。从Transwell和划痕的结果分HFF-1的迁移能力显著高于KLCs和KCs。3.创面愈合结果显示,PBS组第4、8和12天创面愈合率分别为51.80±0.67%、73.80%±0.32、90.20±4.52%;HFF-1组第4、8和12天创面愈合率分别为60.60±0.53%、85.40±0.69%、92.20±3.97%;KLCs组第4、8和12天创面愈合率分别为72.60±4.63%、92.20±6.02%、94.40±3.18%;KCs组第4、8和12天创面愈合率分别为82.80±2.81%、89.00±4.97%、94.80±3.52%,结果表明KLCs和KCs对于创面愈合的治疗效果没有明显差异。4.HE染色结果显示,第4天各组皮肤组织结构严重异常,表皮层脱落,可见大量中性粒细胞浸润;皮肤附件缺失,未见毛囊、皮脂腺及胶原纤维,可见大量纤维素样结构,血管生成等大量病理改变。第8天,PBS组和HFF-1组皮肤组织结构异常,表皮层结构未见明显异常,仍可见大量中性粒细胞浸润;部分区域大量炎性细胞浸润,大量新生血管增生,真皮层未见皮脂腺,毛囊及胶原纤维,但可纤维素样结构;但在KLCs和KCs组,皮肤组织结构基本正常,表皮结构完整,未见细胞变性,表皮下可见大部分正常组织,可见大量皮肤附属物.胶原纤维排列紧密且规则。第12天,PBS组和HFF-1组皮肤组织结构稍有异常,表皮结构比较完整,表皮下可见部分正常组织,可见大量皮肤附属物,胶原纤维明显。排列规则,组织内可见大量炎性细胞;KLCs组和KCs组皮肤组织结构基本正常,表皮结构完整,真皮层胶原纤维排列整齐,皮肤更接近生理状态。3.采用CK5抗体对创面进行免疫组化染色。结果表明,KLCs组和KCs组细胞移植后,表皮和真皮之间残留了一排单细胞,在伤口愈合过程中可能起到了连接作用,KLCs和KCs组的上皮化优于HFF-1和PBS组。4.裸鼠成瘤实验显示,在各组细胞移植后的第40天,KCs和KLCs组细胞无明显肿瘤生成,阳性对照组的肝癌细胞Hep G2在第40天出现肿瘤组织,对肿瘤组织行HE染色和免疫组染色,可见大量的中性粒细胞浸润,局部细胞排列疏松,胞质呈空泡化,组织内大量肿瘤细胞异型显著,细胞核明显呈不规则形状,而KLCs组和KCs组中显示出正常皮肤结构,无上述病理特征,KLCs不具有诱导肿瘤形成的潜力,未来在体内施用中是安全的。二、PI3K/p53/Wnt/LEF1信号通路调HFF-1转分化为KLCs1.m RNA-seq结果表KLCs和KCs两组细胞的m RNA表达谱不同,但表达谱相似。我们根据其动态表达模式分析了显著变化的m RNA,HFF-1转分化为KLCs过程与PI3K/AKT、p53和Wnt/β-catenin信号通路的改变有着密不可分的联系。2.Western-blot、q PCR和免疫荧光结果表明,PI3K/AKT信号通路关键蛋白Akt的磷酸化水平(p-AKT)表达降低,MDM2蛋白表达降低,p53蛋白增高并伴核移位和β-catenin蛋白水平增加后进入胞核与转录因子LEF1结合,使LEF1蛋白水平增加,抑制了ZEB1、TWIST1和SNAIL1蛋白的表达,抑制上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT),可能促进间充质上皮转化(Mesenchymal epithelial transformation,MET)的发生即促HFF-1的转分化。将Wnt/β-catenin信号通路的有效激活剂CHIR-99021和抑制剂XAV939(分别处理HFF-1细胞。激动剂处理HFF-1在第10天时开始发生转化,但这种转化在空白组、PBS组和抑制剂XAV939组中没有发生,同时在分子蛋白水平进一步验证转分化后细胞的特征,发现添加激动剂组细胞,在第10天上皮性标记蛋白Ecadherin表达显著增高。结果表明PI3K/P53/Wnt/LEF1信号通路,在HFF-1转分化为KLCs中起着关键作用。研究结论1、HFF-1在添加10%血清的高糖DMEM培基中连续传代培养超过40天能转分化为KLCs,KLCs与KCs表达相同的标记性蛋白CK5、CK14、CK19、Ecadherin和Integrinβ1,也拥有相似的迁移、增殖和创面治疗能力。2.HFF-1转分化KLCs过程可能受PI3K/p53/Wnt/LEF1信号通路的调控。