一、研究背景 干细胞(stem cell)为一类不分化而长期生存且保持多种分化潜能的细胞群；祖细胞(progenitor cell)为一类分化能力、自我更新、自我维持能力受限制，只有单向或双向分化潜能且生存时间相对较短的细胞群。大量研究证实成体肝脏内存在肝干细胞，卵圆细胞作为一种祖细胞可分化为肝细胞和胆管上皮细胞，它在肝损伤时积极参与肝组织的修复，目前肝干细胞成了国内外研究的热点。肝损伤的异常修复就意味着可能癌变，作为肝干细胞代表的卵圆细胞是否也参与了原发性肝细胞癌(HCC)的形成?这一问题目前还不清楚。肝干细胞的起源和定位怎样?这一问题也存在较大的争议。本课题通过建立HCC动物模型，研究①肝干细胞在肝组织内的定位；②肝干细胞与HCC的关系。 二、目的 本实验旨在探讨以卵圆细胞为代表的肝干细胞在HCC发生、发展过程中在肝组织内分布规律，并通过免疫组化、RT-PCR等技术阐明PCNA、c-kit、c-myc在HCC发生、发展过程中的动态演变规律，从细胞、蛋白、基因三个水平初步研究卵圆细胞向癌细胞异常分化的机制，同时观察乌司他丁对HCC发生、发展的抑制作用，为肝癌的临床预防和治疗探索新的途径。 三、方法和结果 1．DAB诱导建立大鼠肝癌动物模型，并于诱癌全程予以乌司他丁腹腔注射干预，结果显示DAB是一种简单、经济、实惠、有效的肝癌诱导剂；乌司他丁干预组HCC的发生例数显著低于诱癌组，且干预组癌结节面积亦低于同期诱癌组。 2．全程监测肝组织的病理变化，发现HCC发生、发展的过程可分为炎性变期、增生纤维化期、癌变期三个阶段；卵圆细胞首先在炎性变早期出现于汇管区胆管上皮层，随着肝损伤的加重，卵圆细胞逐渐增多，并向小叶内迁移；肝癌形成期，癌结节内及其周边均可见到卵圆细胞。 3．应用免疫组化检测肝癌形成过程中。－kit和PCNA的表达，结果 显示：（）C－kit编码蛋白阳性染色首先大量出现于汇管区，卵圆细胞 可见明显阳性着色，随着肝损伤的加重，肝癌形成，阳性染色仍以汇管 区为主，还可散在出现在小叶内和癌结节内。（2）PCNA阳性表达定 位于细胞核，炎性变早期，表达强度首先以汇管区的卵圆细胞为最高； 炎性变中期，小叶内大量肝细胞亦呈阳性表达，此时，细胞的阳性染色 率达高峰；增生纤维化期，阳性率下降，至肝癌形成期又上升。i 4．采用 RTICR法对 c－myc mRNA的表达水平行定量分析，发现 c－myc mRNA的表达量在肝癌发生过程中呈增高趋势，乌司他丁的干预 对其表达量无明显影响。 四、结论 l．肝损伤初期，卵圆细胞出现于汇管区的胆管上皮层，随着肝损伤 的加重和肝纤维增生，卵圆细胞便沿着肝纤维逐渐向肝小叶内迁移生 长。肝癌形成期，癌结节内及其周边亦可见卵圆细胞分布，因此从细胞 水平说，卵圆细胞对肝细胞癌的形成和发展具有重要作用。 2．对PCNA免疫组化研究发现，肝损伤初期卵圆细胞即表达最强的 增殖活性，可见卵圆细胞具有参与肝损伤修复的重要作用；对肝干细胞 的表面标志抗原c－kit免疫组化研究发现，c．kit基因蛋白定位于汇管区 的卵圆细胞，其表达贯穿于从肝损伤到肝癌发生、发展的全过程。因此 从蛋白水平说，肝损伤的异常修复意味着可能癌变，而癌变的全过程始 终有卵圆细胞的参与。 3．c－myc基因为一种恶性组织的维持基因，从肝损伤到肝癌的形 成，其表达量呈逐渐增高趋势。由于c－myc基因蛋白主要表达于卵圆细 胞，可见从基因水平上说，卵圆细胞参与了肝细胞癌的形成和发展。 4．乌司他丁在肝损伤时对炎性细胞的浸润具有强大的抑制作用，对 肝细胞具有较好的保护作用，对HCC的发展具有一定的抑制作用。