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研究背景:衰老常伴随着全身骨骼骨量逐渐减少,骨质下降和骨强度降低,这通常会导致诸如老年性骨质疏松症等相关疾病。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是多功能干细胞,能够分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等,其分化潜能对维持人体正常骨代谢平衡具有非常重要作用。随着机体衰老,BMSCs功能细胞数量减少,其在骨髓中分化为成骨细胞的潜力下调,同时与衰老有关的分泌物表型分子作用在骨微环境中,抑制BMSCs成骨分化,从而导致与年龄相关的骨量丢失,最终导致骨质疏松症的发生[1.2]。因此,确定与年龄相关的BMSCs衰老及成骨分化方向的调控机制,对治疗老年性骨质疏松意义重大。成熟的骨组织通过BMSCs来源的成骨细胞的骨形成,和造血干细胞(HSCs)产生的破骨细胞的骨吸收,两者之间的平衡活动得以维持。除了这些细胞水平机制,骨骼功能也受表观遗传修饰等控制,包括通过DNA甲基化调节、MicroRNAs(MiRNA,miRs)转录调控和染色质构架修饰等。MiRNA被认为是表观遗传学中基因调控的重要分子,其通过转录后抑制mRNA翻译,从而控制骨骼细胞重塑的维度。然而,目前对于MiRNA如何调节骨重塑中不同细胞之间相互作用的研究有限,MiRNA在调节BMSCs或HSC的骨细胞分化和功能成熟中的作用仍有待阐明[3]。MiRNA是一类内源性小非编码RNA(19-25 nt),它们与mRNA的3’非翻译区(UTR)结合,通过翻译抑制或破坏mRNA稳定,来负调控其靶标基因的表达。研究表明,MiRNA控制着广泛的生理和病理过程,已发现几种MiRNA参与及影响骨生成过程。Davis等报道称,MiR-183-5p在骨源性细胞外囊泡中的表达随年龄增加而增加,减少了 BMSCs的增殖和成骨分化,并促进其衰老[4]。Li et al等已经证明,MiR-188调节成骨细胞衰老过程中与脂肪细胞之间的分化转换,即MiR-188在大鼠BMSCs中特异性过度表达,减少了骨形成并增加了骨髓脂肪的积累[5]。通过靶向调节FoxOl,MiR-182可发挥成骨细胞增殖、分化和骨骼生成的负调节剂,而MiR-216a则促进成骨细胞分化并增强骨形成。尽管有这些发现,MiRNA调节BMSCs衰老及成骨分化的作用机制仍需进一步研究[6]。实验前期,我们发现MiR-384-5p在衰老的大鼠BMSCs中表达异常,但其在年龄相关的骨质疏松症中的影响及作用机制尚无报道。因此,进一步研究MiR-384-5p是否参与调节BMSCs成骨分化及细胞衰老,并探究内在作用机制,进而明确MiR-384-5p对骨质疏松症的发生与进展的影响,不仅有助于深入理解老年性骨质疏松的发病机理,同时又能提供与年龄相关的骨质疏松症潜在的治疗靶点。方法和结果:第一部分MiR-384-5p对BMSCs衰老及骨质疏松生物学效应研究1.MiR-384-5p在老年及去势大鼠BMSCs中表达增高我们构建了 SD大鼠假手术组与卵巢去势组,三月后将两组大鼠股骨石蜡切片行TRAP和Masson染色,结果验证了卵巢去势致骨质疏松模型建立,初步表明了绝经后大鼠破骨活性增强,同时老年雌性大鼠成骨能力减弱,从而导致骨重建失衡,最终导致大鼠骨质疏松进展。为了评估MiR-384-5p与BMSCs衰老及大鼠骨质疏松的关系,我们通过qRT-PCR,分别测量了年轻组(3月龄)和老年组(21月龄)大鼠BMSCs中MiR-384-5p的表达情况。结果显示,老年组大鼠中MiR-384-5p表达水平显著高于年轻组大鼠。2.KD-MiR-384-5p体内注射可延缓老年大鼠的骨质疏松进展为了进一步评估MiR-384-5p对大鼠骨质疏松进展的影响,在18个月龄大鼠股骨骨髓腔中注射搭载MiR-384-5p敲低的慢病毒颗粒(KD-MiR-384-5p)或对照(KD-NC)的慢病毒颗粒行体内实验,以敲减骨髓内细胞MiR-384-5p表达。给药三个月后,qRT-PCR结果表明,与KD-NC对照组相比,KD-MiR-384-5p注射后的大鼠BMSCs中的MiR-384-5p的表达降低。通过Micro-CT分析大鼠股骨远端骨量情况表明,与KD-NC对照组相比,KD-MiR-384-5p注射组老年大鼠骨小梁的骨体积和数量得到改善,骨量丢失减少。第二部分MiR-384-5p诱导BMSCs衰老及负性调节成骨分化的效应研究1.MiR-384-5p过表达可促进大鼠BMSCs衰老因子表达并抑制其成骨分化研究采用MiR-384-5p过表达(OE-MiR-384-5p)及阴性对照(OE-NC)慢病毒颗粒,分别转染大鼠BMSCs。通过qRT-PCR验证了大鼠BMSCs中MiR-384-5p过表达细胞模型建立;根据茜素红染色(ARS)定量钙沉积,分析大鼠BMSCs成骨分化能力;通过衰老相关β半乳糖苷酶染色(SA-β-gal),评估大鼠BMSCs衰老状况;qRT-PCR及WB检测大鼠BMSCs成骨及衰老因子表达情况。结果表明与OE-NC组相比,OE-MiR-384-5p组大鼠BMSCs中的MiR-384-5p表达明显升高,钙盐沉积较少,且表现出更多的细胞衰老,同时成骨特异性基因Ocn,Alp和Osx的mRNA和蛋白质表达水平降低,而衰老相关因子p21和p16的表达增高。2.MiR-384-5p敲低后可抑制大鼠BMSCs衰老因子表达及促进其成骨分化研究采用搭载MiR-384-5p敲低(KD-MiR-384-5p)及阴性对照(OE-NC)的慢病毒颗粒,分别转染大鼠BMSCs。结果表明与OE-NC组相比,KD-MiR-384-5p组BMSCs的MiR-384-5p表达明显降低,钙盐沉积增多,细胞衰老数量减少,同时成骨特异性基因Ocn,Alp和Osx的mRNA和蛋白质表达水平升高,而衰老相关因子p21和p16的mRNA和蛋白质表达水平下降。第三部分MiR-384-5p通过GLI2调节BMSCs衰老及成骨分化的机制研究1.MiR-384-5p与Gli2的3’UTR结合并抑制其表达通过microRNA靶基因预测,我们发现MiR-384-5p靶向调控成骨能力的转录因子Gli2。为了进一步确定MiR-384-5p是否调控Gli2表达,我们构建了包含Gli2 3’UTR的Wt或Mut MiR-384-5p靶序列的荧光素酶报告基因载体。结果表明MiR-384-5p的过表达抑制了 Wt Gli2 3’UTR报告基因的萤光素酶活性,但不抑制Mut报告基因的荧光素酶活性。此外,在细胞实验中,qRT-PCR及WB结果表明,OE-MiR-384-5p组BMSCs在mRNA和蛋白水平上均降低了 Gli2表达,而KD-MiR-384-5p组BMSCs则增加了 Gli2的mRNA和蛋白表达水平。2.抑制 MiR-384-5p后可上调Gli2促进BMSCs的成骨分化为了确定GLI2在MiR-384-5p介导大鼠BMSCs成骨分化和衰老中的作用,采用shGli2 和 shGli2+KD-MiR-384-5p 慢病毒载体分别转染 BMSCs。通过 qRT-PCR 和 WB结果表明,shGli2组BMSCs中Gli2的mRNA和蛋白表达水平降低;ARS及SA-β3-gal染色结果表明,shGli2组BMSCs表现出较少的钙盐沉积和较多的细胞衰老;同时qRT-PCR及WB结果表明,shGli2组BMSCs中特异性成骨基因Ocn,Alp和Osx的mRNA和蛋白质表达水平下降,而衰老相关因子p21和p16的表达明显升高。而shGli2+KD-MiR-384-5组BMSCs则逆转了上述细胞学生物效应。结论:在研究中,我们观察到与年轻大鼠相比,MiR-384-5p在老年及卵巢去势大鼠组的BMSCs中上调。体内试验表明,通过抑制MiR-384-5p作用,可防止骨质流失并促进老年大鼠BMSCs的成骨能力。体外功能测定显示,在年轻大鼠的BMSCs中MiR-384-5p过表达,可抑制BMSCs成骨细胞分化并加速其衰老,而衰老的BMSCs中敲低MiR-384-5p表达后,则具有促进BMSCs成骨细胞分化,并延缓其衰老的生物效应。此外,我们证明了 MiR-384-5p通过直接结合到Gli2 mRNA的3’非翻译区(3’UTR),在mRNA和蛋白水平上都抑制了 Gli2的表达。通过抑制MiR-384-5p表达,可以恢复Gli2促BMSCs的成骨能力。总体而言,我们的研究表明,MiR-384-5p可通过靶向Gli2,抑制BMSCs成骨细胞分化并加速其细胞衰老。MiR-384-5p作为骨生成的负调节剂,最终促进了大鼠骨质疏松的进展。因此,通过抑制MiR-384-5p功能,可能是针对与年龄有关的骨质疏松的治疗靶标。