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研究背景与目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%,其病因复杂,受年龄、环境、生活习惯、遗传等多种因素影响。据资料统计,全球每年120万妇女罹患乳腺癌,且有50万死于该病。在临床能发现肿块前,肿瘤的隐匿阶段平均为12年,肿瘤一旦发生可迅速扩散,病人即将面临化疗及乳房切除的痛苦。因此,更深入的了解乳腺癌发生的分子生物学机制对于寻找乳腺癌早期发现和预后评价的标志物和抗癌药物新的作用靶点以更有效地防治乳腺癌具有重要意义。S100蛋白是一组低分子量的钙结合蛋白,在细胞增殖、分化、细胞运动和细胞周期调控等过程中发挥重要作用。目前发现有25个S100蛋白成员,其中21个都有在1q21的定位,这个区段的染色体具有较差的稳定性,容易发生易位、重叠等染色体重排,提示它与肿瘤关系比较密切。同时,S100A6的基因也定位于1q21,且有多种证据表明它在肿瘤中扮演着重要的角色,但它与肿瘤发生发展的确切关系尚不明确。Wnt/β-catenin信号途径与组织发育和肿瘤的发生发展过程关系非常密切。β-catenin是这个信号途径的关键分子,有学者对乳腺癌组织进行了免疫组化分析结果发现β-catenin与乳腺癌的发生发展相关。环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是合成前列腺素的关键酶,其中COX-2于细胞处于静息时期时不表达,但是当细胞因子、白细胞介素、内毒素、促肿瘤试剂以及癌基因等刺激下可以表达。研究发现,COX-2在乳腺癌、前列腺癌、结直肠肿瘤的发生发展中起着重要作用。本课题拟从S100A6在乳腺癌组织及细胞株中的表达入手,进而研究S100A6对乳腺癌细胞株MCF-7的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响,并探讨S100A6对β-catenin及COX-2表达的影响,为阐明S100A6在肿瘤发生发展中的作用、S100A6对Wnt/β-catenin信号途径及COX-2的作用提供实验依据。方法1.免疫组化法分析乳腺癌患者癌组织及癌旁组织的S100A6表达水平。2. RT-PCR法及免疫细胞化学分析高转移性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)、乳腺癌细胞系(MCF-7)和乳腺转化细胞系(HBL-100)中S100A6 mRNA水平及蛋白水平。3.制备GST-hS100A6融合蛋白:用氯化钙法将对照质粒pGST-moluc和表达质粒pGST-moluc-hS100A6转化E.coli BL21,后经异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,冰上超声破菌后,用预处理的谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)结合蛋白GST和GST-hS100A6, SDS-PAGE电泳后经Quantity One软件鉴定并分析纯化效果,Western-blot法鉴定融合蛋白,BCA法蛋白定量,0.22μm滤膜过滤后分装,-80℃保存备用。4.将不同浓度的融合蛋白GST-hS100A6作用于MCF-7细胞,用MTT法观察hS100A6对细胞增殖的作用。5.根据上一部分试验结果,选取一个合适的蛋白浓度(100μg/ml),用GST-hS100A6作用于MCF-7细胞,经平板克隆形成实验、Hoechst染色、划痕愈合(Wound healing)实验、Transwell侵袭实验检测hS100A6对细胞克隆形成、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。6. Western blot、免疫细胞化学法检测hS100A6干预后MCF-7中β-catenin及COX-2的表达水平及分布变化。结果1.免疫组化法显示,癌旁组织和癌组织均有S100A6表达,但S100A6在癌组织的表达量为癌旁组织的4.1倍(P<0.05);同时,S100A6在癌旁组织中以胞浆和胞膜表达为主,而在癌组织中则以核表达为主。2. RT-PCR显示MCF-7的S100A6 mRNA含量为HBL-100的1.9倍(P<0.05),MDA-MB-231的S100A6 mRNA含量分别为MCF-7及HBL-100的1.7倍(P<0.05)和3.4倍(P<0.05);免疫细胞化学显示三者均有S100A6的表达,经光密度分析后显示MCF-7的S100A6蛋白表达量为HBL-100的2.3倍(P<0.05),MDA-MB-231的S100A6蛋白表达量分别为MCF-7及HBL-100的2.1倍(P<0.05)和5.3倍(P<0.05)。提示S100A6的表达与细胞恶性程度呈正相关。3. SDS-PAGE显示重组蛋白GST-hS100A6大小为36kDa,纯度为94%,Western blot显示其可以被S100A6抗体特异性识别,BCA法测定1 L菌液可收获约16.7 mg蛋白。4. MTT显示细胞培养48h时,浓度为100μg/ml和300μg/ml的GST-hS100A6组的A492nm值较GST组分别增加29.1%和84.6%(P<0.05) ,提示S100A6促进MCF-7细胞增殖,选取100μg/ml进行以下实验。5.平板克隆形成实验显示GST-hS100A6组的克隆形成率较GST组高38.7% (P<0.05),提示S100A6促进MCF-7的克隆形成;Hoechst染色显示GST-hS100A6组在24h时细胞凋亡率较GST组减少67.8% (P<0.05),48h时细胞凋亡率较GST组减少58.4% (P<0.05),提示S100A6抑制MCF-7细胞凋亡;划痕实验显示在24h时GST-hS100A6组的划痕愈合率为GST组的2.2倍(P<0.05),提示S100A6促进MCF-7细胞迁移;Transwell显示GST-hS100A6组在24h时穿膜细胞数较GST组增加88.1% (P<0.05),提示S100A6促进MCF-7细胞侵袭。6.免疫细胞化学结果显示GST-hS100A6作用于MCF-7 24h后, GST-hS100A6组的S100A6蛋白含量为GST组的1.5倍(P<0.0.5),提示外源性重组蛋白GST-hS100A6能够进入MCF-7细胞。GST-hS100A6组的β-catenin表达量为GST组的1.8倍(P<0.05),且核内的表达增加,COX-2表达量为GST组的1.7倍(P<0.05)。Western blot显示细胞内β-catenin水平较GST组增加50%,COX-2水平较GST组增加147%。免疫细胞化学和蛋白质印迹的结果均一致地提示S100A6作用于MCF-7后引起β-catenin及COX-2表达量增加。结论1.在正常乳腺组织中有S100A6的表达,且以胞膜及胞浆表达为主;在乳腺癌组织中,S100A6表达明显高于正常乳腺组织,且以核表达为主。2.在乳腺正常转化细胞株及癌细胞株中均有S100A6的表达,其表达量随细胞的恶性度增高而增加,即S100A6的表达量与细胞的恶性程度呈正相关。3. pGST-moluc-hS100A6在E.coli BL21中成功表达融合蛋白GST-hS100A6;经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠分离纯化纯度为94%,经细胞学实验证实其具有生物学活性,1L菌液中可获得约16.7 mg蛋白。4. S100A6能够促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡,提示S100A6对人乳腺癌具有一定的促进作用。5.外源性S100A6能够上调MCF-7细胞内的β-catenin及COX-2蛋白表达。提示S100A6可能通过上调β-catenin及COX-2的表达发挥对乳腺癌细胞的促进作用。