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5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）也称为血清素,是一种古老的单胺类神经递质,在包括线虫、果蝇和哺乳动物等的许多物种中都有发现。5-羟色胺可以调节许多重要的生理功能和行为活动,包括生殖、睡眠、食欲、学习、痛觉、昼夜节律、情绪、攻击行为、觅食、能量平衡、取食、消化、内分泌和心血管功能等。如果人类的5-羟色胺分泌异常会引起多种疾病的发生,例如精神分裂症、偏头痛、抑郁症、自闭症、强迫症、饮食紊乱、自杀行为等。在昆虫中,5-羟色胺参与昼夜节律、学习与记忆、聚集行为、分泌活动、发育、攻击行为、心率调控等多种生命活动的调节。5-羟色胺特异性的功能是通过结合和激活膜上的受体来实现的,目前己从脊椎动物和无脊椎动物体内克隆得到了 14个5-HT受体亚型,依据它们与第二信使结合情况、药理学特征和序列同源性特点将其分为七类,即5-HT1～5-HT7,除了5-HT3属于配体门控离子通道受体外,其它受体都属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）。从昆虫体内克隆得到的 5-HT 受体主要有 5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A、5-HT7受体,而5-HT2B目前只在果蝇体内有发现,而5-HT受体对拟黑多刺蚁生长发育影响方面的研究,至今未见有过报道。拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina Roger）是一种典型的社会性昆虫,有雌蚁、雄蚁、工蚁等不同品级,隶属于膜翅目蚁科多刺蚁属。拟黑多刺蚁具有明确的社会分工,复杂的行为活动和高级的神经调控,是研究昆虫生长发育和行为调控的良好实验材料。基于以上原因,本研究对拟黑多刺蚁Pv5-HT7受体基因和Pv5-HT2A受体基因cDNA进行了克隆;对拟黑多刺蚁不同发育阶段虫体及不同品级成虫体内这两个基因mRNA和蛋白质的表达水平进行了检测;对不同品级成虫的头、胸、腹部进行了蛋白质表达水平的定量检测;对不同品级成虫脑部及腹部的这两个基因进行了蛋白质表达水平的免疫组化定位检测;采用Y型迷宫训练方法对工蚁进行了训练。本项研究的目的是认识拟黑多刺蚁这两个基因的基本结构,并通过比对的方法从基因的角度了解拟黑多刺蚁与其它物种之间的亲缘关系;了解Pv5-HT7受体基因和Pv5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁生长发育的影响,认识这两个基因对与成虫品级分化相关的脑神经系统结构及生殖系统结构的调节机制:探索这两个基因对蚂蚁学习记忆的影响。通过研究获得以下结果:1.Pv5-HT7受体基因的克隆和序列分析Pv5-HT7受体cDNA（基因登录号KF297572.1）的全长序列为3054 bp,包含有一个790 bp 5’非编码区和一个752 bp 3’非编码区,开放阅读框为1512 bp,编码503个氨基酸。Pv5-HT7受体蛋白的分子量和等电点分别为55.75 kDa和8.44,有一个7个跨膜结构域的疏水结构。系统进化树分析的结果显示Pv5-HT7受体与西方蜜蜂5-HT7受体的亲缘关系最近。Pv5-HT7受体蛋白序列有3个糖基化位点,3个蛋白激酶A磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点以及一个酰基化位点。所有的昆虫5-HT7受体蛋白序列都有一个共同的碳末端,也就是PDZ结构域（Glu-Ser-Phe-Leu）。将Pv5-HT7受体的氨基酸序列与其它物种的5-HT7受体进行对比发现拟黑多刺蚁与昆虫的亲缘关系最为相近,Pv5-HT7受体蛋白与西方蜜蜂、家蚕、黑腹果蝇、菜粉蝶的5-HT7受体蛋白分别有78%、69%、68%、和55%的相似度。2.Pv5-HT7受体在mRNA和蛋白质水平表达的研究Pv5-HT受体mRNA在不同发育阶段虫体和不同品级蚂蚁的成虫体内都有表达,其中在蛹期的表达量比-和1～4龄幼虫期的表达量显著提高。Pv5-HT7受体mRNA在成虫工蚁的表达量最高,其次是雄蚁,雌蚁的表达量最低。由此显示,Pv5-HT7受体可能在蛹期的发育和成虫的品级分化中起重要的作用。工蚁体内的Pv5-HT7受体mRNA高表达可能与工蚁的觅食行为密切相关。利用Western blot方法检测Pv5-HT7受体蛋白在不同发育时期虫体、不同品级成虫和成虫个体不同部位的表达情况。结果显示,Pv5-HT7受体蛋白在蛹和成虫中有表达,而在卵和1～4龄幼虫中几乎不表达。而在成虫中的表达量要远远高于蛹的表达量。成虫中,Pv5-HT7受体蛋白在雄蚁整体的表达量最高,其中在雄蚁胸部的表达最高,而在雄蚁腹部的表达量最低;Pv5-HT7受体蛋白在雌蚁整体的表达量居中,其中在雌蚁头部的表达量最高,在雌蚁腹部的表达量最低;Pv5-HT7受体蛋白在工蚁整体的表达量最低,在工蚁胸部的表达量最低,而在工蚁头部和腹部的表达量都比较高。Pv5-HT7受体的蛋白质检测结果与其mRNA表达水平不完全一致,这可能与该基因在转录及翻译水平的调控机制有关,也可能与Pv5-HT7受体基因分别在mRNA及蛋白表达水平对不同品级成虫调节作用的特异性有关。Pv5-HT7受体蛋白在雄蚁整体及胸部的高表达量,可能表明雄蚁的婚飞行为,雄蚁运动器官的发达程度及运动行为的复杂程度与Pv5-HT7受体基因的调节作用有关。而Pv5-HT7受体蛋白在雌蚁及工蚁的头部表达量比较高,可能与学习记忆行为及整体的协调性有关;Pv5-HT7受体蛋白在工蚁腹部较高的表达量可能与其对工蚁消化功能起着重要的调节作用有关。3.Pv5-HT2A受体基因的克隆和序列分析Pv5-HT2A受体cDNA（基因登录号:KJ666537.2）的全长序列有2965 bp,开放阅读框（ORF）由1926 bp组成,编码641个氨基酸,5’和3’非编码区（UTR）分别为593 bp和446 bp。Pv5-HT2A受体氨基酸序列的分子量为69.68 kDa,等电点为9.60。系统进化树显示拟黑多刺蚁Pv5-HT2A受体蛋白与红收获蚁5-HT2A受体蛋白的亲缘关系最近。Pv5-HT2A受体氨基酸序列有8个糖基化位,5个蛋白激酶A磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点和3个酰基化位点。将拟黑多刺蚁的Pv5-HT2A受体氨基酸序列与其它物种的5-HT2A受体氨基酸序列进行对比发现,Pv5-HT2A受体与其它蚂蚁的5-HT2A受体具有高度的同源性。Pv5-HT2A受体与红收获蚁5-HT2A受体比较显示出84%的相似度,与黑腹果蝇5-HT2A受体比较有57%相似度。4.Pv5-HT2A受体在mRNA和蛋白质水平表达的研究拟黑多刺蚁Pv5-HT2A受体mRNA在不同发育阶段虫体和不同品级成虫中均有表达。其中卵、3龄幼虫及蛹期的表达量较高,1龄、2龄、4龄幼虫的表达量较低;成虫中雄蚁的表达量最高,工蚁的表达量明显高于雌蚁。Pv5-HT2A受体mRNA可能对蛹和雄蚁的发育以及不同成虫品级的分化都起着重要的调节作用。Pv5-HT2A受体蛋白在卵细胞里有高表达,在幼虫期也有表达,其中4龄的表达量最高,1龄次之,2龄低于1龄,3龄最低。在成虫中雄蚁的表达量最高,雌蚁的表达量比较低,在工蚁中几乎不表达。通过比较发现,尽管Pv5-HT2A受体在蛋白质水平的表达与mRNA水平的表达不完全一致,但在卵期的表达具有相对的一致性,而在3龄及4龄的表达不一致。由此显示,Pv5-HT2A受体基因分别在mRNA及蛋白水平的表达对于维持胚胎正常发育及3龄、4龄幼虫的发育具有重要的调节作用。雄蚁中Pv5-HT2A受体基因在mRNA水平的表达与蛋白质水平的表达具有相对的一致性,并且雄蚁中的表达量高于其它两个品级的成虫,由此反映Pv5-HT2A受体对雄蚁的婚飞和攻击行为以及雌蚁交配的主导行为等复杂行为的调节起着重要的作用。Pv5-HT2A受体蛋白在头部的表达量从高到低依次为工蚁、雄蚁和雌蚁。由此推测,Pv5-HT2A受体蛋白与工蚁的觅食行为以及学习记忆行为密切相关。Pv5-HT2A受体蛋白在雌蚁的腹部表达量最高,而在头部表达量最低,这可能与调节雌蚁的生殖能力有关;雄蚁的胸部表达量最高,而腹部表达量最低,这可能与调节雄蚁的运动能力有关。5.Pv5-HT7受体蛋白和Pv5-HT2A受体蛋白的免疫组织化学研究Pv5-HT7受体蛋白在不同品级拟黑多刺蚁成虫脑部的Kenyon细胞、蕈形体和视叶中有强烈的阳性颗粒表达,在触角叶的表达适中,而在蕈形体根、蕈形体α叶表达比较弱。Pv5-HT2A受体蛋白在不同品级拟黑多刺蚁成虫脑部的蕈形体的唇部表达较高,而在领部和基底环表达相对较弱。Pv5-HT7受体蛋白和Pv5-HT2A受体蛋白在不同品级成虫视网膜和视神经层中的表达量最多,而在视外髓和视内髓的表达也比较强烈。蕈形体是昆虫大脑中学习记忆功能的中心,根据其表达状况分析显示,Pv5-HT7受体蛋白及Pv5-HT2A受体蛋白可能参与拟黑多刺蚁的学习记忆行为的调节;可能参与了拟黑多刺蚁视觉的调节和视觉信息的处理,与视觉相关的行为调节有关。Pv5-HT7受体蛋白及Pv5-HT2A受体蛋白可能参与了与成虫品级分化相关的脑神经系统发育和结构特点的调控作用。Pv5-HT7受体蛋白在工蚁和雌蚁腹部中生长期和分化期的卵母细胞中有强烈的阳性表达,在雌蚁腹部的卵黄形成期的卵母细胞和滋养细胞阳性表达也比较强;在雄蚁腹部的精母细胞和储精囊中阳性染色明显。Pv5-HT2A受体蛋白在工蚁腹部中的脂肪体阳性表达较弱;在雌蚁卵黄形成期、生长期、分化期的卵母细胞中和滋养细胞有强烈的阳性颗粒,在雌蚁脂肪体中的阳性表达相对较弱;在雄蚁精母细胞和储精囊中有强烈的阳性着色,而在雄性附腺、射精管以及脂肪体中的阳性表达相对较弱。由此表明,Pv5-HT7受体蛋白及Pv5-HT2A受体蛋白对于雌蚁和雄蚁生殖细胞发育的调节起着重要的作用。Pv5-HT7受体蛋白及Pv5-HT2A受体蛋白可能参与了与成虫品级分化相关的腹部生殖系统发育及结构特点的调控作用。6.迷宫训练对Pv5-HT7受体和Pv5-HT2A受体基因表达影响的研究。利用Y型迷宫对拟黑多刺蚁工蚁进行行为训练,随着实验次数的增加,工蚁找到目标的时间越来越短。对未训练和训练后的工蚁体内Pv5-HT7受体mRNA和Pv5-HT2A受体mRNA相对表达量进行检测,发现行为训练后的工蚁Pv5-HT7受体mRNA和Pv5-HT2A受体mRNA的相对表达量都有所增加,这可能是因为行为训练会刺激工蚁脑部的5-HT水平上升,从而诱导Pv5-HT7受体mRNA和Pv5-HT2A受体mRNA表达量的增加,这说明了Pv5-HT受体和Pv5-HT2A受体与拟黑多刺蚁工蚁的学习记忆行为的调节密切相关。本研究首次从拟黑多蚁体内克隆得到了Pv5-HT7受体基因和Pv5-HT2A受体基因的全长cDNA序列。系统进化分析结果显示Pv5-HT7受体基因和Pv5-HT2A受体基因与其它种类的蚂蚁或膜翅目昆虫的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,Pv5-HT7受体基因和Pv5-HT2A受体基因无论在mRNA水平还是蛋白质水平在不同发育阶段虫体和不同品级成虫的蚂蚁体内均有不同程度的表达,由此反映这两个基因对拟黑多刺蚁的发育及品级分化起着重要的调节作用;由于这两个基因的mRNA及蛋白质在拟黑多刺蚁的不同发育阶段虫体、不同品级成虫及成虫个体头、胸、腹体段内的表达量存在着一定的差异,由此显示这两个基因对拟黑多刺蚁的特定发育阶段,成虫的品级分化及不同品级成虫的特异性功用具有一定的调节作用。上述的研究内容之前均未见有过报道,由此表明本项研究为深入了解Pv5-HT7受体基因及Pv5-HT2A受体基因对于调节社会性昆虫蚂蚁生长发育及品级分化具有重要的意义;本项研究为进一步探Pv5-HT7受体基因及Pv5-HT2A受体基因对于高等动物乃至人类的发育及疾病的发生发展过程所起的应有作用奠定了良好的基础。