【摘 要】
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D-氨基酸作为多种药物合成的中间体、食品添加剂和化妆品活性成分,被广泛应用于食品、制药、农业和化妆品等领域。D-氨基酸的合成方法主要有化学合成法和生物合成法。生物酶法合成D-氨基酸具有温和、高效、节能、环保等优点,而利用多酶级联反应可以提高催化效率,避免中间体堆积,因此被广泛应用于D-氨基酸的合成。本实验室构建了一套由来自Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶（PmLAAD）、来自S
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D-氨基酸作为多种药物合成的中间体、食品添加剂和化妆品活性成分,被广泛应用于食品、制药、农业和化妆品等领域。D-氨基酸的合成方法主要有化学合成法和生物合成法。生物酶法合成D-氨基酸具有温和、高效、节能、环保等优点,而利用多酶级联反应可以提高催化效率,避免中间体堆积,因此被广泛应用于D-氨基酸的合成。本实验室构建了一套由来自Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶（PmLAAD）、来自Symbiobacterium thermophilum的二氨基庚二酸脱氢酶（StDAPDH）和来自Burkholderia stabilis的甲酸脱氢酶（BsFDH）组成的多酶体系,可级联催化L-苯丙氨酸（L-Phe）转化为D-苯丙氨酸（D-Phe）。然而,该多酶体系仍存在一定的不足之处,如关键酶PmLAAD底物谱较窄（主要催化L-Phe）、关键酶StDAPDH催化活力较低以及游离酶组成的体系传质效率不高等。本论文主要从关键酶分子改造和催化体系构建这两个方面对该多酶体系进行催化性能提升,具体结果如下:（1）利用半理性设计的策略对PmLAAD进行改造。通过对底物结合位点附近的关键残基E417进行饱和突变,成功扩大了PmLAAD的底物谱。通过扩大PmLAAD的底物入口通道,构建E417L、E417A等突变体,提高了对大体积底物L-色氨酸的活性。E417位点突变为碱性氨基酸,构建了E417K、E417H、E417R等突变体,使PmLAAD对一系列L-氨基酸底物的活性有普遍性的提高。其中,突变体PmLAADE417K对7种L-氨基酸底物的活性与野生型相比都有提高,包括L-丙氨酸（3.77倍）、L-天冬氨酸（1.41倍）、L-异亮氨酸（1.34倍）、L-亮氨酸（1.29倍）、L-苯丙氨酸（1.05倍）、L-色氨酸（6.65倍）和L-缬氨酸（1.68倍）。通过结构分析发现,E417位点突变导致的PmLAAD活性提高与其底物入口通道的大小及静电状态有关。（2）利用基于氢键相互作用的亲和多肽构建自组装多酶体系。针对D-氨基酸合成关键步骤中StDAPDH和BsFDH的偶联,利用一对亲和短肽RIAD/RIDD对StDAPDH和BsFDH两种酶进行了自组装体系构建。尝试将短肽分别连接在酶的C端和N端,分别构建了St-AD（即在C端连接RIAD短肽的StDAPDH）、St-DD（即在C端连接RIDD短肽的StDAPDH）、Bs-AD（即在C端连接RIAD短肽的BsFDH）、Bs-DD（即在C端连接RIDD短肽的BsFDH）、AD-St（即在N端连接RIAD短肽的StDAPDH）、DD-St（即在N端连接RIDD短肽的StDAPDH）、AD-Bs（即在N端连接RIAD短肽的BsFDH）和DD-Bs（即在N端连接RIDD短肽的BsFDH）。进行了不同组合的组装实验:St AD-（BsDD）2、BsAD-（StDD）2、AD-Bs-（St-DD）2、AD-St-（Bs-DD）2、AD-St-（DD-Bs）2、St-AD-（DD-Bs）2、AD-Bs-（DD-St）2和Bs-AD-（DD-St）2。通过同源建模和结构分析,发现RIAD（或RIDD）短肽大部分被包埋在了酶的多聚体结构内部,从而显著影响了RIAD/RIDD的自组装,表明RIAD/RIDD短肽自组装的效率及适用性受限于目的酶的多聚体结构。（3）基于肽键的末端共价相互作用构建自组装多酶体系。利用一对可自发形成异构肽键的短肽SpyTag（SpyT）/SpyCatcher（SpyC）,构建了StDAPDH和BsFDH的自组装体系。SpyT或SpyC被连接在酶的N端以构建自组装体系（SpyT-St）-（SpyC-Bs）和（SpyC-St）-（SpyT-Bs）,其中仅（SpyT-St）-（SpyC-Bs）实现了自组装。考察了温度、孵育时间和蛋白比例等条件对自组装效率的影响,确定了最佳组装条件为SpyT-St和SpyC-Bs的蛋白浓度比例为1:1添加,30℃温浴30 min。对（SpyT-St）-（SpyC-Bs）组装体系的催化效率进行了研究,结果表明其级联催化PPA转化为D-Phe的催化效率是同浓度游离酶的1.3倍。
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