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隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)是特殊的HBV感染形式。由于OBI携带者血液中HBsAg呈阴性,因而临床上很少被识别,也未纳入乙肝诊疗的范围。但是越来越多的证据表明其可能影响HBV慢性感染的结局,甚至导致肝癌的发生。关于OBI的发生机制未有定论,其中可能的因素为病毒本身的改变,因此本研究基于前期大量样本的分析,从病毒角度探索HBVS蛋白的突变和修饰在OBI发生中的作用。2010年1月至2013年12月间,本实验室收集了来自全国各地29个血站的1261份HBsAg-/HBVDNA+献血者样本,确认了其中982例为OBI。我们对970例信息完全的OBI献血者宿主或病毒信息进行统计分析,并按照血清学状态进行分组统计。随机抽取275份OBI样本进行S区测序,成功测序116份。同期还在同一人群中成功测序530份HBsAg阳性样本用作对照组。本研究从S蛋白的糖基化和跨膜结构域突变两个方面对116份OBI和531份对照序列比对分析,识别候选突变并对候选突变进行功能验证。研究方法采用定点突变技术将候选突变引入目标野生型质粒,并转染到huh-7表达,检测细胞内外表面抗原的水平,并用WB进行验证。结果显示970例确认的OBI献血者男性占70%,重复献血者占39.7%,中位年龄为40岁(范围18-60岁),未见ALT异常案例。绝大部分(69.1%)样本的HBV DNA 水平低于 12 IU/mL。血清学模式分为 anti-HBc+/anti-HBs-占 68%(659),anti-HBc+/anti-HBs+占 25%(242),anti-HBc-/anti-HBs+占 7%(69)。测序结果分析发现,OBI组S蛋白糖基化突变(40.7%vs 11.8%,P<0.001)和TMD区亲水性氨基酸替换频率(65%vs 25%,P<0.001)高于HBsAg阳性对照组。我们选取MHR区的7个位点的9个新增糖基化突变和3个废除糖基化突变进行功能验证。WB结果显示除了 GSS112-114NAT其他突变全部成功引进新的糖基。在质粒M88和p38.Ⅱ上,除了 TCT123-125NCT/NFT,其他突变并未显著改变胞外HBsAg水平。对于质粒M86,所有新增糖基化突变导致胞外HBsAg下降到野生型的1/10甚至1/1000,废除146位点糖基化突变导致胞外HBsAg上升至10倍左右,分泌效率(胞内胞外HBsAg之比)与胞外HBsAg有一致的变化。另外,我们选取TMD1-3区7个R替换进行功能验证,结果表明TMD2中的R替换使胞外胞内HBsAg降至检测限以下,而TMD1和TMD3中的R替换没有导致HBsAg显著变化。综上,新增糖基化突变通过阻碍分泌而导致胞外HBsAg下降,TMD2区的亲水性氨基酸替换导致胞内外极低的HBsAg水平,从而导致血液循环中无法检测到HBsAg,因而很可能是OBI的发生的机制之一。本研究为更全面的阐明病毒因素在OBI发生中发挥的作用提供了新的角度和证据,为OBI的深入研究奠定基础。