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研究目的:葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)是一种由小肠K细胞合成并分泌的一种肠促胰岛素分泌肽,通过与胰岛β细胞上GIP受体(GIPR)结合,刺激餐后胰岛素的分泌。现在研究发现,GIP还是一种促肥胖激素,能够与脂肪细胞上GIPR结合,促进脂肪合成和储存,是高脂膳食摄入情况下,肥胖和瘦素抵抗发生的驱动因素。红花黄色素(saffloweryellow,SY)是传统中药红花的主要水溶性成分。本课题组前期研究表明,SY对高脂膳食诱导的肥胖(DIO)小鼠还具有减肥作用,且灌胃干预的减肥效果比腹腔注射更佳,提示SY可能主要通过胃肠道发挥减肥作用。因此,本研究旨在探究SY基于小肠(GIP)-脂肪(GIPR)轴的减肥和改善瘦素抵抗的作用及其机制。研究方法:本研究涉及动物实验和细胞实验两部分。动物实验:C57BL/6J雄性小鼠给予高脂饲料喂养9周,构建高脂膳食诱导肥胖(diet-induced obesity,DIO)小鼠模型,再随机分为 4 组(n=10/组):普通饮食对照组(SF-Saline),高脂膳食对照组(HFD-Saline),高脂膳食125mg/kg SY干预组(HFD-125mg/kg SY),高脂膳食 250mg/kg SY 干预组(HFD-250mg/kg SY)。干预组分别给予125mg/kg和250mg/kg的SY灌胃,每天一次,共12周,对照组给予等量生理盐水灌胃。实验期间:(1)每周称量2次体重并记录3次摄食量。(2)干预8周后,依次行腹腔注射葡萄糖耐量试验,口服葡萄糖耐量试验,腹腔注射胰岛素耐量试验。(3)干预9周后,行瘦素敏感性试验。(4)干预10周后,将小鼠放入代谢笼,进行能量代谢监测。(5)干预12周后,处死小鼠,取小鼠脂肪组织和肝脏重量称重。(6)取部分附睾脂肪组织、肝脏和小肠用10%甲醛固定,进行H&E染色和免疫组化染色。(7)提取肝脏、皮下和附睾脂肪组织RNA,采用RT-qPCR方法检测脂肪组织中瘦素和GIPR及其受体后信号通路相关基因,和肝脏组织中脂肪合成和分解相关基因的mRNA水平。(8)收集血清,检测血清生化指标的变化。(9)收集盲肠内容物,提取DNA,行肠道菌群16S rRNA全长(V1-V9)扩增子测序。细胞实验:1.小鼠STC-1小肠内分泌细胞系:体外培养STC-1小肠内分泌细胞系,给予10、50和100mg/L SY干预12h,收集细胞培养上清液检测GIP水平,同时观察SY对STC-1细胞中GIP及其调控因子基因的表达变化。2.小鼠3T3-L1前脂肪细胞系:体外培养3T3-L1细胞系,然后诱导分化为成熟的脂肪细胞。给予10、50和100mg/L SY干预24h,采用RT-qPCR和western blot方法观察GIPR和瘦素及其信号通路相关基因的mRNA和蛋白水平的变化。然后再使用1nmol/L GIPR激动剂(GIP1-30)和SY干预脂肪细胞,观察SY的上述效应是否因GIPR被激动而发生改变。3.人HepG2肝癌细胞系:体外培养HepG2肝癌细胞系,给予400μM棕榈酸(palmitic acid,PA)溶液干预12h构建“脂肪肝”体外细胞模型,10、50和100mg/L SY干预24h后,分别采用油红O染色和RT-qPCR的方法,观察SY对HepG2细胞内脂质含量以及脂肪合成、分解基因表达的影响。研究结果:动物实验结果如下:1在整体水平上:(1)125mg/kg和250mg/kg的SY灌胃干预后,DIO小鼠的摄食量分别降低至HFD-Saline组的85.0%和90.8%;体重增长量分别降低HFD-Saline组至56.0%和44.6%(P均<0.05)。(2)在OGTT和IPGTT中,与高脂膳食对照组相比,125mg/kg和250mg/kg SY干预组小鼠血糖下降更快;在IPITT中,小鼠对外源性胰岛素反应更灵敏。因此,AUC也较高脂膳食对照组明显降低(P均<0.05)。进一步发现,125mg/kg和250mg/kg SY干预后,OGTT的AUC均较IPGTT试验明显降低,分别减少到IPGTT的85.4%和87.8%(P均<0.05)。而高脂膳食对照组中,OGTT和IPGTT的AUC无明显差异。提示,SY可能通过影响胃肠道激素的分泌改善DIO小鼠糖耐量。(3)能量代谢监测显示,125mg/kg SY干预组小鼠的能量消耗是高脂对照组小鼠的1.1倍(P<0.05)。(4)瘦素敏感性试验发现,SY干预组中,与注射生理盐水的小鼠相比,注射外源性瘦素的小鼠体重增长量和摄食量均显著降低(P均<0.05)。(5)250 mg/kg SY干预后,DIO小鼠血清瘦素水平明显降低(P<0.05)。2在组织水平上:(1)免疫组化结果显示,与高脂膳食对照组相比,125mg/kg和250mg/kg SY干预组小鼠小肠黏膜上皮GIP染色明显变浅,提示SY可以抑制GIP的表达。(2)H&E染色结果表明,125mg/kg和250mg/kg SY干预后,小鼠附睾脂肪细胞体积均明显变小,肝脏脂肪变性也显著减轻。(3)125mg/kgSY干预后,DIO小鼠皮下脂肪组织中GIPR的表达降低至高脂膳食对照组的51.1%,而附睾脂肪组织中的IL-6表达降低至对照组的33.7%(P均<0.05)。(4)125mg/kgSY干预后,DIO小鼠皮下脂肪组织中瘦素受体的表达增加至高脂膳食对照组的3.6倍,而细胞因子信号转导抑制分子3降低至对照组的31.6%(P均<0.05)。250mg/kg SY干预后,皮下脂肪和附睾脂肪组织中瘦素受体的表达增加至HFD-saline组的3.3 倍和 2.8 倍(P均<0.05)。(5)125mg/kg 和 250mg/kg SY 干预后,DIO小鼠肝脏组织中脂肪酸合成酶(fattyacidsynthetase,FAS)的表达也分别降低至对照组的46.8%和47.5%(P均<0.05)。(6)盲肠内容物肠道菌群16S rRNA全长扩增子测序显示,SY干预可以显著增加DIO小鼠盲肠内容物中Bacteroidesacidifaciens和Bacteuroidesvulgats菌的相对丰度。细胞实验结果如下:1.小鼠STC-1小肠内分泌细胞系:(1)给予50和100mg/L的SY干预12h后,STC-1细胞培养上清液中GIP水平分别降低至对照组的72.4%和60.5%(P均<0.05)。另外,STC-1细胞中GIP的mRNA水平也分别降低至对照组的84.7%和85.7%(P均<0.05)。(2)进一步研究发现,不同浓度SY干预还可以显著减少GIP转录调节因子,包括调节因子 X6(regulatory factor x6,Rfx6)、胰腺和十二指肠同源盒-1(pancreatic and duodenal homeobox 1,Pdx-1)、ISL-1 和 GATA4 等基因的表达(P均<0.05)。2.小鼠3T3-L1前脂肪细胞系:(1)给予50mg/L的SY干预24h后,3T3-L1脂肪细胞中瘦素的mRNA和蛋白水平分别降低至对照组的42.7%和74%(P均<0.05);同时信号转导及转录激活因子3磷酸化水平增加,增加至对照组的1.48倍(P均<0.05)。(2)100mg/LSY干预后,GIPR的表达降低至对照组细胞的74.8%,IL-6和促进甘油三酯合成的硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)的mRNA水平也分别降低至对照组的85.0%和59.6%(P均<0.05)。(3)同时使用1nmol/L GIPR激动剂(GIP1-30)和50、100mg/LSY干预24h后,3T3-L1脂肪细胞中瘦素的mRNA水平与单独使用GIP组无明显差异,提示SY抑制瘦素的作用消失。3.人HepG2肝癌细胞系:(1)给予400μMPA干预HepG2细胞12h后,油红O染色定量分析显示,细胞内脂质含量升高至对照组的1.5倍,提示“脂肪肝”体外细胞模型构建成功。10,50,100mg/L的SY干预24h后,PA造模的HepG2细胞内脂质含量分别降低至对照组细胞的的80.5%,80.5%和73.8%(P均<0.05)。(2)进一步检测发现,脂肪合成相关基因乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和胆固醇调节元件结合蛋白等基因的mRNA水平也明显降低。研究结论:1.125mg/kg和250mg/kg SY灌胃干预对DIO小鼠均具有显著的减轻体重、抑制摄食、改善糖代谢和肝功能的作用,且125mg/kg SY的减重和改善糖脂代谢作用较250mg/kg更显著。2.SY的作用机制,一方面通过抑制GIP转录调节因子的表达,减少DIO小鼠小肠GIP的表达和分泌;另一方面通过抑制脂肪组织GIPR及其受体后信号通路,降低血清瘦素水平,最终发挥改善肥胖脂肪组织瘦素抵抗的作用。3.SY的减重和改善糖脂代谢作用还可能与恢复肠道菌群稳态有关。