【摘 要】
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目的:本研究基于蛋白质组学筛选出猪囊尾蚴排泄分泌抗原富含亮氨酸重复序列结构域15（Leucine-Rich Repeat Containing 15,LRRC15）蛋白,经平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）验证后,对其进行真核表达,进一步观察LRRC15蛋白对仔猪T细胞免疫应答的影响。方法:1.将收集和制备的囊尾蚴以及囊尾蚴ESA进行蛋白提取后,经胰酶
【基金项目】
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国家自然科学基金（81960378）；
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目的:本研究基于蛋白质组学筛选出猪囊尾蚴排泄分泌抗原富含亮氨酸重复序列结构域15（Leucine-Rich Repeat Containing 15,LRRC15）蛋白,经平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）验证后,对其进行真核表达,进一步观察LRRC15蛋白对仔猪T细胞免疫应答的影响。方法:1.将收集和制备的囊尾蚴以及囊尾蚴ESA进行蛋白提取后,经胰酶酶解,通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定,结合GO功能注释、亚细胞定位等分析,运用PRM验证,寻找囊尾蚴排泄分泌抗原（Excretory secretory antigen,ESA）中高表达的差异蛋白。2.利用生物信息学在线软件预测LRRC15蛋白的理化性质、亲水性、跨膜区域、信号肽预测、亚细胞定位、二级结构、三级结构和抗原表位。通过基于PCR的精确合成（PCR-based accurate synthesis,PAS）方法全基因合成LRRC15,克隆至真核表达载体pc DNA3.4,转入Top10感受态细胞,挑取阳性克隆子测序和双酶切鉴定重组质粒pc DNA3.4-LRRC15,转染至人胚肾HEK293细胞表达,通过Ni柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化后的LRRC15蛋白。3.用LRRC15蛋白刺激正常仔猪外周血PBMC和脾脏CD4+T细胞,分析T细胞免疫应答情况:（1）在PHA处理下,以RPMI 1640、ESA、ConA为对照组,LRRC15蛋白刺激PBMC,流式检测CD4+、CD8+T淋巴细胞数量变化;（2）LRRC15蛋白刺激PBMC,流式检测CD4+CD25+Foxp3+、CD8+CD25+Foxp3+Treg细胞表达水平;（3）在有无LPS存在下,用LRRC15蛋白刺激PBMC,ELISA检测培养上清中IL-10的分泌水平;（4）分析不同时间段（24 h、48 h、72 h）LRRC15蛋白对初始CD4+Th细胞分化的影响。首先分离诱导仔猪髓源性DC,加入LRRC15蛋白刺激,流式检测DC表面标志物CD80、CD86、MHCⅡ的表达量,ELISA检测细胞培养上清中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α分泌水平;（5）随后分离出仔猪脾脏CD4+T细胞并与未成熟髓源性DC共培养,加入LRRC15蛋白刺激,ELISA检测24 h、48 h、72 h共培养上清中IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、IFN-γ的分泌水平。结果:1.通过囊尾蚴及其排泄分泌抗原蛋白质组学分析,鉴定出囊尾蚴中高表达蛋白有475个,ESA中有331个,根据GO功能注释、亚细胞定位和蛋白表达差异筛选出LRRC15蛋白。2.生物信息学分析结果显示,LRRC15蛋白属于亲水性蛋白,由644个氨基酸组成,含1个信号肽和1个跨膜区域及多个抗原表位,具有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲的分泌性蛋白,并富含亮氨酸结构域;成功构建重组质粒pc DNA3.4-LRRC15,经人胚肾HEK293细胞表达出分子质量约为70 KDa的LRRC15目的蛋白。3.LRRC15蛋白刺激PBMC后,CD4+T淋巴细胞数量增加（P＜0.05）,并诱导CD4+CD25+Foxp3+、CD8+CD25+Foxp3+Treg表达（P＜0.05）,但不能诱导IL-10的分泌。4.LRRC15蛋白在有无LPS存在情况下,均可诱导DC表面标志物CD80、CD86、MHC Ⅱ表达增加（P＜0.05）,但抑制DC分泌细胞因子IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌（P＜0.05）。LRRC15蛋白在24 h、48 h、72 h均诱导IL-4、IL-17分泌水平降低（P＜0.05）;LRRC15蛋白诱导24 h与48 h相比,IL-5分泌水平升高（P＜0.05）,IL-5在72 h的分泌水平与48 h无明显变化（P＜0.05）;LRRC15蛋白诱导IFN-γ分泌水平升高（P＜0.05）,在24 h、48 h、72 h分泌水平无显著性差异（P＞0.05）;LRRC15蛋白在三个时间段均不能诱导IL-10分泌（P＞0.05）。结论:1.LRRC15蛋白可诱导仔猪PBMC中CD4+/CD8+T细胞免疫失衡,诱导Treg细胞表达,可能通过非依赖性IL-10途径发挥免疫抑制作用,推测可能与TGF-β分泌有关。2.LRRC15蛋白可诱导早期Th1型免疫应答和后期Th1/Th2混合型免疫应答。
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